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高内涵成像技术在单抗结合检测中的应用（一）

2020.6.16

优点 1.无需冲洗的检测方法提高效率，减小浪费 2.应用范围广，可用于贴壁细胞，悬浮细胞及免疫磁珠 3.可用任何波长的荧光标记 4.高敏感度可检测低丰度抗原单抗结合检测方法的发展大大提高了细胞及免疫磁珠的高通量，高内涵分析效率。这种不用冲洗，基于荧光微孔分析技术（fluorometric microvolume assay technology, FMAT）的方法可以快速的针对更少量的细胞进行筛选，而且在传统样本检测中由于多次洗板造成的细胞损失也完全可以避免。抗体的发现在诊断疾病，研发疫苗和治疗疾病的过程中起到重要作用。研究者们利用杂交瘤细胞或者形成克隆来筛选高表达克隆株，检测细胞表面的抗体结合效率，观测抗体或配体在细胞内的内化。在传统的FMAT检测方法的已有优点之上，利用ImageXpress® Micro 宽场高内涵分析系统进行操作的单抗结合检测方法可以让科学家们在同一个平板孔中检测多种不同细胞的表面抗体结合情况。这一系统也可以将检测规模提升到1536孔板，并且只需要2-3微升的样本。即使用更低的二抗浓度，其检测范围和灵敏度也不会下降，甚至有所提高。 检测原理 抗体被富集在磁珠上并用带荧光的二抗进行标记。荧光成像技术可以检测被磁珠捕获的抗体数量。利用类似的方法同样可以检测细胞表面结合的配体以及配体和抗体的内化。在单抗结合检测过程中（图1），应将贴壁细胞，悬浮细胞或抗体包被磁珠样本加入到96,384,1536孔板中。然后加入一抗（目标抗体），接着用二抗对一抗进行标记来检测一抗的结合情况。所有的检测试剂加到微孔板后都无需冲洗。细胞或抗体包被的免疫磁珠被固定在孔板底部表面，即使孔板底部有高背景荧光，阳性信号也可被识别并分析。 线性和检测范围 在第一个实验中，我们将不同浓度的一抗滴定使之与7微米的磁珠结合。加入被分析物，用二抗标记并利用 ImageXpress Micro 高内涵分析系统成像。传统的FMAT检测方法只能利用红色（Cy5）通道进行检测，而ImageXpress Micro系统可以捕捉到多种波长图像，所以任何二抗标签都可以用来标记及检测。在这个滴定实验中，二抗是用DyLight 488标记的。 MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件中应用Count Nuclei 模块对图像进行分析，所得出的最低检测阈值（LLD）为0.5ng/ml（30pg/well），线性响应大概在1-31ng/ml。此次一抗滴定实验的曲线显示出了“前带现象（prozone）”，以及与单抗结合检测相关的“钩状现象（hook effect）”。在曲线顶峰的信号衰减是由于未结合的一抗在介质中与二抗结合，使之未能与细胞和磁珠结合所致（图2）。免疫磁珠的一抗结合曲线见上图。12.7微米包被羊抗小鼠抗体的磁珠被结合到不同浓度的小鼠lgG抗体上，并加到微孔板中，在孔板中与标记AlexaFluor488的二抗室温下共孵育1-2个小时，实验设四个复孔及同型抗体对照孔。图像为10X PlanFluor物镜拍摄。孔板的缩略图（下）清晰的显示出抗体结合的浓度梯度。分析结果：LLD 为0.5 ng/mL (30 pg/well)，在1-31ng/mL之间呈线性关系。

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高内涵成像技术在单抗结合检测中的应用（一）

周锦帆