CRISPR-Cas9基因编辑的两种不同编辑实验流程的应用（三）
Alt-R® CRISPR-Cas9实例分析
1、特别优化的crRNA/tracrRNA/sgRNA长度，提高编辑性能
以HPRT基因中的12个位点为靶点，分别使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA
XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，与Alt-R® Cas9核酸酶组装成3种RNP，加入2μM Alt-R®
Cas9电穿孔Enhancer，转染HEK-293细胞，培养48小时后，通过二代测序检测总的编辑效率，结果显示其具有很好的稳定性。
2、化学修饰RNA，增加核酸酶抗性，减少免疫应答和细胞毒性
以HPRT1的12个位点为靶点，分别用Alt-R®
crRNA:tracrRNA、体外转录（IVT）RNA，转染可高效表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK-293细胞，24小时后，测定常见应激反应基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表达水平。（A）qPCR显示IVT
RNA强烈诱导IFIT1，而Alt-R® RNA无影响。（B）qPCR显示IVT RNA对OAS2的诱导可测，而Alt-R®
RNA处于基线。同时IFITM1、RIGI、OAS1等3个应激反应相关基因均得到相似结果，说明Alt-R® RNA不会激活细胞先天免疫反应。
3、优化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特异性切割
4、电穿孔Enhancer，提高转染效率，尤其是原代细胞等较难转染的细胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9复合体），通过Lonza Nucleofector
核转染K562细胞（A）、Jurkat细胞（B）、HEK-293细胞（C）时，使用电穿孔Enhancer（深蓝色）、不使用（浅蓝色）的编辑效率。
5、HDR Enhancer，提高同源重组修复效率
①提高多种细胞HDR
以人HPRT为靶点，使用Lonza Nucleofector核转染系统，将4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R®
tracrRNA、Alt-R® Cas9组装），加入4μM Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer，以3μM IDT
Ultramer寡核苷酸作为同源重组修复DNA模板，转染人多种细胞系。电转后，细胞培养在含30μM Alt-R® HDR
Enhancer的培养基中（绿色），或培养在含有DMSO的培养基中作为阴性对照（棕色），HEK-293、HeLa培养48小时，Jurkat、K562培养72小时，通过限制性片段长度多态性（RFLP）、靶序列PCR进行HDR分析，显示Alt-R®
HDR Enhancer可提高多种细胞类型的同源重组修复效率。
②提高多种基因HDR
）
以人基因组多个位点为靶点，将4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer、3μM IDT
Ultramer单链DNA模板，通过电穿孔转染。电转后，细胞分别培养在含30μM Alt-R® HDR
Enhancer的培养基（蓝色）、含有DMSO的培养基（绿色）、未处理的培养基（棕色），48-72小时后，通过RFLP、PCR进行HDR分析，显示Alt-R®
HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在线CRISPR序列设计工具，方便地设计高质量的crRNA/sgRNA/同源重组修复DNA模板/引物等
如物种的基因组富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位点不适合，IDT同时提供CRISPR-Cas12a系统，尽可能满足编辑需求。
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