CRISPR-Cas9基因编辑的两种不同编辑实验流程的应用（一）
IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因编辑系统
IDT（Integrated DNA
Technologies）作为核酸定制合成领域的知名企业，依托30年来的技术研发，推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因编辑产品，通过对gRNA序列、Cas9核酸酶优化，对RNP转染效率、同源重组修复HDR效率的提升，形成了从crRNA设计到CRISPR编辑结果检测的一站式解决方案，让CRISPR-Cas9系统更高效、更简单。
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系统，分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对化脓性链球菌S.
pyogene Cas9内切酶结构域进行突变，获得了高精确性的单链、双链剪切功能，再通过电穿孔（如Lonza
Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。
传统构建CRISPR-Cas9质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas9，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas9组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶，进而提高了基因编辑效率。
Alt-R® CRISPR-Cas9实验流程
【方法一】
1、（使用IDT序列设计工具）设计Alt-R® crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；
2、将Alt-R® crRNA与Alt-R® tracrRNA混合，通过crRNA的重复序列区（Repeats）与tracrRNA碱基配对, 形成向导RNA（guide RNA，简称gRNA）；
3、将gRNA与Alt-R® Cas9蛋白混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；
4、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
5、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif，简称PAM），对DNA进行剪切；
6、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
