原位杂交操作规程
(一)、仪器设备
医用微波炉; 水浴锅。
(二)、试剂
0.2mol/L HCl:HCl 8.2ml,H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml,H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml,NaCl 5g,浓HCl 4ml,H20 定容0.98L,醋酸酐 (用前加)2.5ml。20×SSC(pH7.0):NaCl 175.3g,枸橼酸钠 88.2g,H20 定容1L。100×Denhardt's:Ficoll 1g,PVP 1g,BSA 1g,H20 定容50ml。杂交液:Formamide 5ml,20×SSC 2.5ml,Dextran sulfate 1g,100×Denhardt's 0.5ml,10%SDS 0.5ml,10g/L sperm DNA 0.1ml,H20 1.4L。BufferⅠ(pH7.5):0.1mol/L ris·Cl,0.15mol/L NaCl。BufferⅢ(pH9.5):0.1mol/L Tris·Cl,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ(pH8.0):10mmol/L Tris·Cl,1mmol/L EDTA。
(三)、操作流程
1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
1) 二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;
2) 无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;
3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;
4) PBS清洗3分钟;
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;
6) PBS清洗10分钟;
7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育