线粒体分离实验
实验材料 细胞
试剂、试剂盒 RSBMS 缓冲液
仪器、耗材 Dounce 匀浆器
实验步骤
1. 用 11 ml 冰上预冷过的 RSB 重新悬浮细胞，转移到一个 15 ml 的 Dounce 匀浆器中
RSB（使组织培养细胞膨胀的低渗缓冲液）
10 mmol/L NaCl
2.5 mol/L MgCl2
10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
2. 让细胞膨胀 5~10 分钟。用相差显微镜监测膨胀过程。
3. 用研杵 B ( 小间隙型）研磨几下使膨胀细胞破碎。
4. 立刻加入 8 ml 2.5x MS 缓冲液至终浓度为 1x MS。用封口膜封住匀浆器顶端，倒转数次使溶液混匀（如果要进行标志酶检测，还要留下部分匀浆 )。
2.5 x MS 缓冲液：
525 mmol/L 甘露醇
175 mmol/L 蔗糖
12.5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
2.5 mmol/L EDTA，pH 7.5
1 x MS 缓冲液：
210 mmol/L 甘露醇
70 mmol/L 蔗糖
5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
1 mmol/L EDTA，pH 7.5
5. 将匀浆转至离心管中进行差速离心。用少量 MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中，用 MS 缓冲液将体积加至 30 ml。
6. 匀浆在 1300 g 离心 5 分钟以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
7. 将上清倒在一个干净的离心管中。
8. 重复“沉淀细胞核”步骤两次。
9. 将上清移至一干净离心管中，17000 g 离心 15 分钟沉淀线粒体。
10. 弃去上清，用 Kimwipe 吸干离心管内表面。
11. 1X MS 重悬浮沉淀以漂洗线粒体，重复 17000 g 离心步骤。
12. 弃上上清，用适合后续工作的缓冲液重悬浮沉淀。
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