植物线粒体制备及其亚结构分级分离实验（一）
实验材料 黄化苗
试剂、试剂盒 匀浆缓冲液清洗缓冲液Percoll 梯度溶液
仪器、耗材 分光光度计
实验步骤
在选好植物材料和匀浆缓冲液后，接下来关键的因素包括匀浆方法、缓冲液的 pH、使用的缓冲液与植物组织之间的比例、研磨时间及温度等（见注释 5) 。
3.1 匀浆
根据植物组织的不同可以采取不同的匀浆方法，或者几种匀浆法结合运用。
( 1 ) 直接用预冷的研钵和研槌进行匀浆。
( 2 ) 在烧杯中用 Moulinex 混合器匀浆 20~60s，或者用 Polytron 搅拌器在 50% 的全速下搅拌 5 次，每次 2s。
( 3 ) 在陶瓷搅拌器中高速下搅拌 15s，或低速下搅拌 2 次，每次 15s。
( 4 ) 用商用蔬菜或水果榨汁机将块茎直接榨汁到 5X 匀浆缓冲液中。
( 5 ) 直接用搓板在匀浆缓冲液中将材料搓碎。
3.2 缓冲液 pH 以及与材料的比例
( 1 ) 使用前匀浆缓冲液的 pH 必须调到 7.8 左右，以确保在细胞破碎后的整个系统 pH 仍能保持在 7.0~7.6。
( 2 ) 对于某些特殊的植物组织，可能需要使用较多的匀浆缓冲液或者匀浆后使用 5 mol/L KOH 或 NaOH 调节以保证最后的 pH 在 7.0 以上。
( 3 ) —般来讲，鲜重每克非绿色组织需用 2 ml 匀浆缓冲液，每克绿色组织则需用 4 ml。降低缓冲液的使用量会大大降低线粒体的提取效率。
( 4 ) 在从块茎组织中提取线粒体时，使用较少的缓冲液也能有较高的提取效率，可能是因为该组织中酸类化合物含量较低的原因。
3.3 过滤及差速离心获得细胞器粗提物
( 1 ) 匀浆液必须经过 4 层纱布在漏斗上过滤到烧杯或锥形瓶中，残留在纱布中的匀浆液可以直接拧到滤液中。过滤必须在 4~10°C 条件下进行。
( 2 ) 将滤液转移到预冷的离心管中（体积依滤液的多少而定，可以是 50 ml、250 ml 甚至 500 ml) ，然后在 1500 g 下用固定转角的转头离心 5 min。转头需预冷至 4°C。
( 3 ) 所得沉淀为淀粉粒、核及细胞碎片。将上清液小心转移至新的离心管中，然后 18000 g 离心 15 min。高速离心所得粽褐色或黄色或绿色沉淀即为含有各种细胞器的粗提物。
( 4 ) 用 5~10 ml 标准清洗液 [ 如 0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH、pH 7.2 和 0.1% ( m/V ) BSA ] 将细胞器粗提物重新悬浮。如果匀浆缓冲液中所用渗透介质为蔗糖，则 0.3 mol/L 甘露醇应改为 0.3 mol/L 蔗糖。
( 5 ) 将重新悬浮的液体转移至 50 ml 的离心管中，用清洗液调整体积至 40 ml 后 1000 g 下离心 5 min。
( 6 ) 上清液转移至新的离心管中，18000 g 离心 15 min。去掉上清液，沉淀用小量体积的清洗液重新悬浮均匀（见注释 6)。
3.4 密度梯度离心纯化线粒体
经上述步骤所得的线粒体可以用来进行呼吸效率的测定。但是根据其组织来源的不同，所得的线粒体常常混有类囊体或淀粉体膜、过氧化物酶体、乙二酸循环体、内质网及细菌，需要经过 Percoll 密度梯度离心进一步纯化。
( 1 ) 将清洗过的线粒体溶液注入到 Percoll 梯度的表面，一般从 80 g 黄化植物组织或 40 g 绿色植物组织中提取的线粒体用 35 ml Percoll 梯度溶液，使用 50 ml 的离心管进行离心（见注释 2) 。
( 2 ) 35000 g 离心 45 min，使用转角转头，降速时不设置「 brake」减速。
( 3 ) 离心后，线粒体呈浅黄色条带，位于绿色的叶绿体或黄色的质体膜条带之下 ( 图 7-2)。用巴斯德吸管将线粒体部分吸出后（避免吸入质体）用 4 倍体积的标准清洗液稀释，然后 18000 g 离心 15 min。
( 4 ) 所得松软沉淀可再次用清洗液悬浮，并在同样速度下离心 15 min。最后所得线粒体沉淀可按 5~20 mg 线粒体蛋白/ml 清洗液（可用 Bradford 或 Lowry 法定量）重新悬浮溶解。
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