Western Blot Protocol实验操作步骤
一、提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置 5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),12000×g,4℃离心 10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置 20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入 100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各样品10ul，加DW990ul
2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml。
3.向各管加入2.5mlD试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%Na2CO3、 0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4.迅速加入酚试剂0.25ml，混匀37℃水浴30分钟。
5.721分光光度计650nm，比色，S0标准管调零。
6.最后稀释为 4ug/ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug/ul，上样量为30～80ug/泳道。
三、电泳
1.makegel．
11%分离胶 12ml 两块胶 | 4%积层胶6ml两块胶 |
DW4.36 ml | DW堵漏3.66ml |
3M Tris3.0 ml | 0.5M Tris1.5 ml |
30%Arc4.4 ml | 30%Arc0.5 ml0.78 ml |
10% SDS0.24 ml | 10%SDS60 ul |
10%APS0.12 ml | 10%APS20ul30 ul |
TEMED10ul | TEMED5ul6ul |
2.上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。
3.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1. 将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2.转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1. 取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2.NcM用PBS冲洗二遍，呈 5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封闭，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3.将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4.加入一抗1:1000－1200，室温，反应1小时
5.PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6. 加入二抗1:5000，室温，反应1小时。
7.PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1. 混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2.放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3.显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液4×1L：
NaH2PO4（·H2O） | 12.48g |
Na2PO4·12H2O | 114.6g |
NaCl | 3.6g |
dw 800ml, adjustpHto7.0,adjustVolto1 L |
（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛 血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
500ug / ml BSA | NS | 蛋白浓度ug / ml | |
S1 | 50 ul | 1.95 ml | 12.5 |
S2 | 100 ul | 1.90 ml | 25 |
S3 | 200 ul | 1.80 ml | 50 |
S4 | 400 ul | 1.60 ml | 100 |
S5 | 800 ul | 1.20 ml | 200 |
3. 30%Acrylamide
29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60 mlDDW，调Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
称Tris 36.3g溶于水到100 ml，调pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
称Tris5.98g溶解后，调pH到6.7，调体积到100ml
6. Samples buffer 10ml
10%SDS | 2 ml | |
甘油 | 1 ml | |
0.5MTris | 1.6 ml | 用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚兰、0.5% DTT贮备液。 |
DDW | 5.2 ml |
7.电转液1LpH 8.2－8.3
Glycine | 14.42 g |
Trisbase | 3.02 g |
dH2O | 800 ml |
Methanol | 200 ml |
10% SDS | 2 ml |
8.pH 7.2PBS2 L
NaCl | 18.0g |
KCl | 0.44g |
Na2HPO4 | 2.84g（7.16g） |
NaH2PO4 | 0.432g（0.562g） |
加DW到2 L |
9.10×电极缓冲液400 mlpH 8.4
Tris base | 12.2 g |
甘氨酸 | 57.76 g |
加DW 400 ml, 调pH8.4，用前加SDS0.1% |
10.脱色液1号
甲醇 | 250 ml |
冰醋酸 | 50 ml |
＋DW到500 ml |
11.脱色液2号
甲醇 | 100 ml |
冰醋酸 | 75 ml |
＋DW到1000 ml |
