Southern Blotting实验原理、操作步骤和注意事项-2
按先将水和DNA 按反应体系所需的量取至一1.5毫升离心管中，混匀，短暂离心至管底，放至100℃干浴中变性10 min，变性探针迅速置于冰浴上 5 min，按反应体系将反应混合液（dNTP，Random primer，Klenow ）加入变性DNA中，在同位素操作台上，加入32P 标记的dNTP（a-32P dCTP*，放射性比活>3000Ci/mmol），30℃温育3小时以上。
1.杂交
将标记好的探针，补加300µl杂交液，100℃变性（or 0.4N NaOH变性），加入杂交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。杂交前作标记效率测定，>25%以上可以往下做杂交， 过夜杂交。杂交效率受杂交速率及杂交稳定性影响。
2.洗膜：从低严谨度到高严谨度冼膜液（具体情况而定）：
1×SSC/0.1%SDS洗膜两次（冷5min，热65℃，15min）®检测信号强度
®0.5×SSC/0.1%SDS 热冼 65℃, 15min ®依情况可有改动0.2×SSC/0.1%SDS or 0.1×SSC/0.1%SDS。
3.包膜：膜从洗膜液中捞出，在滤纸上晾干，膜表面无可见水膜为止（注意：不能太干，以防探针难以洗脱影响再次使用），用保鲜膜包膜，压X-光片，置于-20或-70℃ 3—7 天（依据信号强弱掌握曝光时间）
4.冲洗X-光片
在暗室红灯下取出X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来（显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到2分钟），转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（约10分钟）。自来水冲洗干净后，晾干，读片。
5.膜上探针洗脱
再次使用膜前，必须洗去上次探针！
附注：
1. 杂交效率的影响因素
a)杂交温度：双链DNA分子，T=Tm-20—25℃可达最大杂交率，DNA-RNA杂交分子则低于Tm 值10-15℃。
b)离子强度(1.5M/L NaCl杂交率最高)
c) 双链长度(形成杂交物长度) ：杂交率与双链长度成正比
d)探针的复杂程度 (重复性探针可以增加杂交率)
e)pH5.0-9.0基本无影响。
2. 影响杂交稳定性（影响解链温度的）因素
a) 离子强度 在0.01-0.4M NaCl之间, 每10×单价阳离子，Tm16.6℃
b) 碱基组成 AT<CG（在NaCl溶液中）；
c) 去稳定剂（destabilizer） DNA-DNA杂交分子，每1%formamide,Tm¯0.6℃；6M urea可降低Tm30℃
d)碱基错配：每 1%的错配可使Tm降低1℃
e)双链长度（探针杂交物） >500bp基本无影响
3．整个实验过程中应注意的事项：
1)保证转膜质量；
2)操作规范；
3)提高杂交灵敏度（信号强度）；
a) 探针量及标记量（探针变性）；
b)比活（性）度 >=108dpm/u(<108弱)；
c)靶 DNA量（绝对量，酶切转膜决定；相对量，靶DNA相对于探针过量时，完全配对杂交，探针过剩时，完全配对和非严格的完全配对均有发生）；
d) 有惰性聚合物增加灵敏度；10%(w/v)500,000(mw)dextran sulfate或8%(w/v)PEG6000。对于单链探针，可以增加10-fold杂交信号，dsDNA成100-fold地增加杂交信号 4) 提高特异性：
a)高盐溶液促进探针与靶序列的碱基配对20×SSC 3M NaCl/0.3M Na3Ci
b) 杂交后洗膜温度T®Tm
c)杂交后洗膜液浓度组成，高严谨度洗膜液使不完全配对的杂交失去稳定，致使探针脱落
d) 杂交时间 8hrs 以后，DNA探针逐渐退火，少量自由与靶DNA杂交.
e)探针长度（>1000bp）过长，高严谨度下难洗脱非完全配对杂交探针。
4．放射性同位素：
1) 放射性同位素发出的射线主要有：
a粒子：外照射，一般能量的α粒子穿透能力较弱，射程短，危害性小，稍加防护即可（如手套）；内照射，电离密度大，危害大。
b粒子：穿透能力比α粒子强，外照射危害比α粒子大，可引起皮肤的放射损伤。
g 射线：穿透能力很强，外照射时危害性很大，应采取切实有效的防护措施。
2) 放射性活度及单位：
放射性活度A是指一定量的放射性核素在时间间隔dt内发生自发核衰变数dN与此时间间隔的比值。即A=dN/dt
放射性活度的单位是Becquerel(贝克勒而)，简称Bq。
1Bq=1个衰变/秒；1居里=3.7×1010Bq
其不表示放射出射线的多少（如60Co 一个原子衰变防出1个b粒子和一个g光子，而一个32P原子只衰变出一个b粒子），也不表示射线能量的大小。
3) 辐射防护的目的:
防止发生对健康有害的确定性效应(接受放射性治疗的患者除外), 并将随机性损害效应的发生降低到被认为可以接受的水平，从而保障放射工作人员、公众及其后代的健康与安全，提高放射防护措施的效益，促进放射工作的发展。
4)放射防护的原则：
a)辐射实践的正当化：生产必须，医疗必须，科研教学必须
b)辐射防护的最优化：即综合考虑社会、经济等诸因素之后，使个人剂量的大小、受照人数的多少和不确定发生的照射事件的发生概率可合理达到的低水平。
c)个人剂量限制：为了保证每个人不致受到不合理的危害，必须制定一个个人剂量限制值，放射工作人员的剂量限制：全身均匀照射的年当量剂量限值H全身=50mSV; 不均匀照射时，有效剂量E不应超过H全身。
5)外照射的防护措施：
a)距离防护：人体受到照射的剂量率随着离开电离辐射源的距离的增大而减少。剂量率与距离的平方成反比。
b)时间防护：在剂量率不变时，剂量与时间成正比，即操作时间越短，人员所受到的照射剂量越小。（
要求放射性作业应操作熟练、操作步骤应尽量简单易行，尽量减少在辐射场所逗留的时间。）
c)屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐减弱的原理，可以设置一定的屏障物来进行防护。常用的材料有水、砖、大理石、混凝土、重金属铅等。
d)利用衰变：可利用放射性物质存在自发衰变，其活性随之减少的原理进行外照射防护。如：半衰期小于15天的放射性废物，允许放置10个半衰期后作一般废物处理。
6)内照射的防护措施
防止放射性物质经呼吸道吸入
防止放射性物质食入
防止放射性物质经体表进入
