父子关系的分子分析实验——PCR 分析多态位点实验
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 尽管基于 Southern 的 RFLP 检测是一种很有效的、近乎艺术级的确定生物学关系的手段，但 PCR 技术在常规的父子关系的检测中越来越常用。商业化的用于多态区间扩增的试剂盒包含了使用生产商预制的酶溶液、各种缓冲液和引物的方案，以及它们对 DNA 浓度、时间和 PCR 扩增循环次数的建议；然而需要特别指出的是不同位点的扩增可能需要对一般的扩增条件做一定的修订，这由进行此项工作的实验室自行决定。PCR 分析的所有方案以 gDNA 开始，因此，如果 RFLP 分析要与 PCR—同进行的话，在进行限制性酶切之前（基本方案 1，第 1 步）需要把起始生物学样品各自分开，备 PCR 分析用的样品留待扩增使用。 表 9.6.2 为通过 RFLP 与 PCR 方法进行父子关系检测的比较。 ASO 探针最常用的基于 ASO 的系统是已商业化的 AmpliType PM + DQAl PCR Amplification and Typing 试剂盒，其包含所有的实验指导，以及扩增和分型 6 个独立位点需要的反应组分（表 9.6.3)。 序列特异性探针条带在父子关系检测中并不常使用，主要在于其相对低的排除率及购买试剂盒费用较高。但其在法医学个体确认中仍然有用，此时需要匹配整个遗传物质的遗传方式而不是单个等位基因，得到的是不同的统计学数据。对 3 个不同个体以及阴性、阳性对照个体的多位点标记物分析的结果如表 9.6.4 所示。 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AmpFLP)特定的引物与每个待检个体的非消化 gDNA 特异结合扩增，根据其中重复片段的大小不同可将 AmpFLP 分为两类。长串联重复片段（longt and omrepeat,LTR) 和短串联重复片段（Shortt and omrepeats，STR) 都有可变数目的重复片段，均可通过 PCR 进行分析。 长串联重复LTR 的重复片段大小在 10?80bp，其等位基因大小在 300~1000bp，杂合度在 95% 左右。 短串联重复在个体确认的检测中所用的 STR 大多是 4bp 的重复单位，等位基因大小在 100~350bp，杂合度一般在 65%?85%。表 9.6.5 列出了一些常用的 STR。更多此类位点的信息可以访问：http://www.promega.com/tbs/tmd008/tmd008.html。 电泳和检测手动系统在手动系统中，尽管有一些高分辨率的琼脂糖凝胶可用，但 PCR 产物最常用聚丙婦酰胺凝胶电泳，如 MetaPhor 和 NuSieve(FMCBioProducts)。准确的条件取决于要分离产物的大小和给定的溶液条件（如附录 3F、CPMB 单元 2.5A 或 Sambrook^a/.，1989)0 半自动系统 LTR 和 STR 的 PCR 产物也可通过半自动系统进行分离、检测和分析。该系统包括基于凝胶的、整合电泳、检测和分析于一个功能单元（PCR 片段必须是荧光标记的）和荧光显像系统。 自动系统在著此书时，用于 LTR 和 STR 分析的唯一完全自动的系统就是通过毛细管电泳 (capillary electrophoresis，CE)。正如其名称所暗示的，电泳是在毛细管而不是在玻璃板之间进行。CE 的缺点在于目前只有单毛细管系统可用，所以一次只能进行一个样品的分析。尽管如此，因为 CE 可在一个比常规高出许多的电压下进行，其可在 20 min 左右的时间内完成片段的分离，这可以弥补其通量有限的缺点。 支持方案1 全血 gDNA 的制备
支持方案2 母亲及声称父亲的 DNA 图谱数据的阐述、统计学估算和报告
支持方案3 特殊父权关系个案的 DNA 图谱的阐述、统计学估算和报告
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