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SNP检测——HRM技术应用

2020.7.13

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs),指单个核苷酸碱基的改变,包括置换、颠换、缺失和插入,导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中,绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象,这就是SNP。SNP在人类基因组中数量较多,发生频率较高,因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。

HRM检测SNP技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性,期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化,可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列,因而也就有了独特的熔解曲线形状,如同DNA指纹图谱一样,具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子(下图)。

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检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点,如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点,一般采用PCR+测序的方法,成本高、操作繁复较低。

作为新一代的遗传扫描工具,HRM技术是一种低成本、高通量、快速,且不受位点局限的检测方法,是SNP筛查的最佳选择。其具有"简、效、快、廉"等其他技术难以比拟的优势:

简:无需序列特异性探针,不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点:闭管操作,避免交叉污染。

效:最低检测0.1%-0,01%的突变或异常甲基化检测SNP灵敏度和特异性均为100%,。

快:1次同时不多于384个样本,在60-90分钟内完成检测。

廉:简化操作步骤、降低人工和试剂成本,费用远少于测序、Taqman探针等方法。

HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析,是不同于基因芯片检测方法(检测位点多,样本少)的高通量方法。同时,也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。

  附表之SNP相关研究方法:

研究方法

优点

缺点

直接测序法

SNP分析的金标准,能发现已知和未知SNP位点

每个位点均需要经PCR扩增,然后测序,成本较高,工作量大,周期特别长,价格昂贵,不适合大样本做疾病关联分析,且容易交叉污染。

Taqman探针法(定量PCR)

适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测

价格昂贵(探针合成费用高),不能同时发现未知SNP位点

非探针的普通PCR方法

技术简便,价格便宜,仅适用已知SNP判断,不能确定何种SNP,适宜少量样本的实验室检测

费时费力,速度较慢,灵敏度差;RFLP仅能检测有酶切位点的 SNP,无酶切位点不能检测;上述方法都需要凝胶电泳,DNA链二级结构容易造成人工假相,使结果出现偏差。SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限,难以大规模开展工作。

芯片技术

与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点

仅适用于全基因组SNP扫描,不适宜单个基因的SNP位点检测,精度低,价格昂贵。

Illumina 技术

这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时,还能够检测多个感兴趣的区域,从而检出罕见的基因突变。

高通量SNP检测,用于SNP在全基因组上的扫描分析,价格昂贵。

MALDI-TOF MS质谱技术

检测速度快,理论上能分开单个碱基变化

这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰,精确度难以保证。这种方法适宜于已经优化的特定SNP检测,不适宜该服务商未做过或很少做过的新SNP检测。检测过程需要多点质控,否则精确度很低。另外,很重要的一点是这个检测PCR过程和质谱过程是分开的,PCR需要自己做,并不便宜。

基于罗氏LightCyclerTM 480的HRM技术

高通量、简单、快速、省钱、高灵敏度;闭管检测,避免污染造成的假阳性;扩增区内已知和未知SNP都能检测;灵敏度和精确度达到近100%HRM分析和PCR是在同时进行,无需另外仪器,相比MS等减少了额外仪器,无疑成本更低,非特异性和精确度更好。

须用罗氏LightCyclerTM 480 PCR仪,或LightScannerTM等仪器


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