生物大分子的离心分离实验（三）
例（6）用Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子
样品：初步离心后的蛋白-核酸混合液梯度液：
3.00g Cs2SO4
2.5ml 8M 尿素（经过混合床去离子处理的）
50μl 1.0M Tris-HCl（PH7.4）
25μl 0.2M EDTA（PH7.4）
1.25ml 样品的水溶液
以上各项充分混合后注入5ml PA 快速密封管
固定角式转头 130,000xg，5℃ 离心64 小时，慢减速
或600,000xg，5℃ 离心14 小时，慢减速
甩平转头 400,000xg，5℃ 离心22 小时
·结果分析：其中蛋白用35S 同位素标记
RNA，DNA 用32P 同位素标记
离心后样品分布收集成30 管，在液闪仪上测定，绘出从离心管表面—>管底的容量为横坐标，同位素32P， 35S 计数为纵坐标的曲线图，很明显可以找到蛋白，DNA，RNA 的峰位置。
例（7）用RbCl 梯度分离不同密度的蛋白质：
配置：样品：经过初步分离的蛋白质 50μg-200μg
1.75g RbCl
0.5ml 1M Tris-acetate （PH7.1）
水容量=3.25ml
（充分混合后注入离心管）
固定角式转头，5ml PA 管
250,000xg，5℃ 65 小时，慢减速
或 600,000xg，5℃ 27 小时，慢减速
甩平转头 400,000xg，5℃ 42 小时
离心后沿离心管长度方向分部收集成50 管。
用分光光度计分别测各管O.D.值，以管容量为横坐标，O.D.值为纵坐标绘制曲线， 可以找到各种蛋白的峰位置。
例（8）用CsCl-Cs2SO4 梯度分离RNA 片断：
配置：
1.9ml 饱和的CsCl 液
1.7ml 饱和的Cs2SO4 液
1.5ml RNA样品（5-10μg 溶于0.1M Tris-HCl（PH7.5）及10mM EDTA）
0.25ml DMSO（5%）
充分混合后注入5ml PA 离心管
离心二次： 第一次170,000xg，25℃， 18 小时（固定角式转头）
第二次100,000xg， 25℃， 48 小时（固定角式转头）离心后沿离心管长度方向收集30-50 管，用比重计测密度。
（因为是CsCl 与Cs2SO4 混合梯度，不能用光折射仪测RI）。
结果：横坐标为管容量，纵坐标为密度绘制曲线，可以找到不同密度RNA 所在位置。
例（9）用NaBr 梯度分离血清脂蛋白：
（i） 溶液配置：
干燥的NaBr 晶体，在210℃恒温箱中过夜，分别配置下列不同密度的NaBr 液体：
1.006克/毫升（9 克/升）
1.019克/毫升（27 克/升）
1.063克/毫升（95 克/升）
1.210克/毫升（283.4 克/升）
1.386克/毫升（524.8 克/升）
所有的溶液均含0.05% EDTA（PH7.0），溶液经过滤后储存在暗褐色瓶中，4℃保存。
（ii） 实验过程
（1） 人全血1,000xg 离心10 分钟去除各种血细胞，上清液为血清。
（2） 0.2ml 血清与0.8ml，1.386 克/毫升的NaBr 液混合。
（3） 将已稀释的血清样品1ml 置于14mlPA 管底部，然后往上依次铺设梯度液
3.2ml,1.21g/ml NaBr 液
3.8ml,1.063g/ml NaBr 液
3.3ml,1.016g/ml NaBr 液
1.2ml,1.006g/ml NaBr 液
（4）甩平转头，260,000xg，14℃，24 小时
各种密度的脂蛋白从管底浮向它们自己的等密度区形成了纯的各种密度脂蛋白区带。而离心管底部保留着各种血清蛋白。
（5） 用上排法从离心管中抽出各层液体，由蠕动泵输送经过带流动池的紫外可见分光光度计经检测光密度（O.D.）值后用部分收集器收集于0.5ml eppendorf 管中。
（6） 从分光光度计的O.D.曲线，可以从0.5ml 离心管中给各种不同密度血清脂蛋白定位。
（7） 结果：
血清脂蛋白代号及名称 | 收集管编号 | 从14ml 离心管上液面向下计算的容积（ml） |
VLDL（极低密度脂蛋白） | 1-2 | 0.5-1.0 |
IDL（较低密度脂蛋白） | 3-4 | 1.5-2.0 |
LDL（低密度脂蛋白） | 5-9 | 2.5-4.5 |
HDL1（高密度脂蛋白） | 10-12 | 5.0-6.0 |
HDL2（较高密度脂蛋白） | 13-17 | 6.5-8.5 |
HDL3（极高密度脂蛋白） | 18-20 | 9.0-10.0 |
（8）也可以用NaBr 的连续梯度（从1.003 克/毫升-1.200 克/毫升）来进行血清脂蛋白分离，甩平转头，95,000xg，4℃，2 小时，也可以得到类似结果。
参考文献：
（1）D.Rickwood 等
“ Centrifugal methods for characterizing macromolecules and their interactions” Oxford.Uni.Press 1992
(2) B.D.Hames 等
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(3) C.J.Howe 等
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IRL Press.Oxford 1990
(4)E.S.Ward 等
“Nucleic acid Sequencing: a practical approach”
IRL Press. Oxford 1989
(5)J.B.C.Findlay 等
“Protein Sequencing: a practical approach ”
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(6)余兴明：“质粒DNA 的超速离心分离”
“生命的化学”1994.1
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(8)余兴明：“密度梯度离心基础”
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（9）M.Dobrota “Conditions for density Gradient Separations”
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