感受态细胞的制备
材料、设备及试剂
一. 材料
E. coli DH5α，BL21菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；T-vectorDNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。
二. 设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
三. 试剂
1.LB固体和液体培养基
2.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,摇匀后铺板。
3.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
操作步骤
一、 受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml
LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml
LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
