荧光pH探针于细胞内pH检测的使用（一）
细胞内pH在各种细胞事件中起重要的调节作用，包括细胞生长，钙调节，酶活性，受体介导的信号转导，离子转运，内吞作用，趋化作用，细胞粘附等等。借助pH敏感的荧光指示剂，研究人员能够以更高的灵敏度、空间分辨率、采样密度来监控活细胞内的pH波动。
通常，细胞的细胞内pH在其各个细胞区室之间会有所不同。例如，胞质溶胶的pH值介于6.8至7.4之间，而酸性细胞器（如溶酶体）的pH值介于4.5至6.0之间。因此，选择pH指示剂时，重要的是使其酸度系数（pKa）与实验系统的pH相匹配，我们提供多种荧光pH指示剂，pH指示剂葡聚糖结合物和其他试剂，用于生物系统中的pH的检测。
1. 近中性pH的检测
BCECF及其膜渗透性AM酯是用于测量细胞内pH的最广泛使用的荧光pH指示剂。它的pKa约为6.98，非常适合测量各种细胞类型的胞质中的pH变化，以及监测近中性环境中的pH变化。BCECF在〜504 nm处有一个最大吸收，在〜440 nm处有一个等吸收点，在〜527 nm处有最大发射。尽管BCECF具有双重激发的比值特性，但一些特性使比值成像不理想。其等吸收点与最大激发之间距离较大，细胞内保留性较差以及在440 nm处的弱吸收，都导致其信噪比较低。此外，BCECF以异构体的复杂混合物形式提供。
RatioWorks™BCFL，BCECF的高性能替代产品
RatioWorks™BCFL是AAT Bioquest设计的新型比值型指示剂，用于优化BCECF的不良性能和异构变异性，与BCECF相似，RatioWorks™BCFL的pKa约为7，最大吸收在503 nm处，最大发射在528 nm处。但是，RatioWorks™BCFL具有约454 nm的等吸收点，等吸收点的这个红移非常适合比值成像，因为它使RatioWorks™BCFL产生的信噪比明显高于BCECF。
RatioWorks™BCFL比值型成像技术使细胞内pH值测定基本上独立于几个可变因素，包括染料浓度，光程长度，细胞渗漏和光漂白速率。RatioWorks™BCFL可以作为不渗透膜的酸使用，也可以作为胺反应性琥珀酰亚胺酯用于标记抗体和蛋白质。
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| BCFL激发光谱 | BCFL发射光谱 |
RatioWorks™BCFL的主要功能：
适用于细胞内pH的单波长成像和比值型成像
信噪比较BCECF高
改善了细胞保留能力，将背景干扰降至最低
单一异构体设计可提供更一致和可重现的结果
适用于荧光显微镜，流式细胞仪和基于荧光酶标仪的测定
图1. 使用RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）和BCECF，AM（Cat#
21202）产生的标准曲线。将Hela细胞与5 µM RatioWorks™BCFL，AM在37°C下孵育30分钟。用Spexyte™
Intracellular pH Calibration Buffer Kit（Cat#
21235）中的细胞外缓冲液固定细胞内pH在4.5-8.5之间，取4个数据点的平均值，并用4参数拟合曲线，得到pH 6到8的标准曲线。
