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双杂交和其他双成分系统实验( 一)

2019.3.25

实验材料	载体和酵母菌
试剂、试剂盒	缓冲液和溶液 SDS 凝胶上样缓冲液 SDS 聚丙烯酰胺凝胶核酸和寡核苷酸抗体培养基
仪器、耗材	专用设备
实验步骤	第一阶段诱饵-LexA 融合蛋白的鉴定材料缓冲液和溶液将贮存液稀释到适当浓度。 2XSDS 凝胶上样缓冲液 100 mmol/L Tris-Cl(pH6.8) 200 mmol/L 二硫苏糖醇 4%SDS(电泳级） 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油不含二硫苏糖醇的 SDS 凝胶上样缓冲液可在室溫存放。缓冲液用前在 1mol/L 贮存液中加入二硫苏糖醇。凝胶 SDS 聚丙烯酰胺凝胶制备蛋白质分离用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，请见附录 18。核酸和寡核苷酸编码目标蛋白（诱饵）的靶 DNA 抗体抗 LexA 的单克隆抗体（CLONTECH) 或抗 LexA 的多克隆抗体（Invitrogen) 或抗靶蛋白质融合域的特异性抗体（如果有的话）。培养基酵母培养基的成分请见附录 2。 CM 选择性培养基用表 18-3 估计褥要培养基的量，用表 18-4 制备必需的选择性培养基。商品销售的无氧基酸的酵母氮源（YNB) 有含硫酸胺和不含硫酸胺两种。表 18-4 假定 YNB 含硫酸胺。如杲盛酵母氮源的瓶子上指示加 1.7 g/L 来配置培养基, 它就不含有硫酸胺，应当在每升培养基中加 5 g 硫酸胺。酵母选择性 X-gal 培养基 1. 按表 18-4, 以 900 ml 水制备基础培养基。将基本培养基高压灭菌并冷却到 55°C。 2. 在另一个瓶子中，以 100 ml 蒸馏水溶解 7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠，然后髙压菌。 3. 将两种高压灭菌的溶液混合在一起，并加入 0.8 ml 浓度为 100 mg/ml 的 X-gal(在 N,N-二甲基甲酰胺中), 铺平板。 YPD 培养基 20 g 蛋白胨 10 g 酵母提取物 20 g 葡萄糖 20 g 琼脂（如果用于平板）加 1L 蒸馏水并高压 20 min。铺板前将高压灭菌的培养基冷却到 55C。专用设备干冰/乙醇浴锅请见步骤 13。平头牙签，灭菌的灭菌时，将标准牙签转移到 250 ml 烧杯中，用铝铂纸包盖烧杯，在标准干燥条件下高压灭菌。预设到 100°C 的加热包或热循环仪，或沸水浴。附加试剂本方案第 1 步需要亚克隆试剂，列在第 1 章方案 17。本方案第 2 步需要酵母转化试剂，列在 Spector 等的文献中（1998, 第 21 章）。本方案第 17 步需要免疫印迹试剂，列在附录 8。载体和酵母菌选择和扩增载体用的酿酒酵母菌（请见表 18-6) 带 LexA(请见表 18-1) 和活化域融合序列（请见表 18-2) 的载体，以及 LacZ 报道子质粒（请见表 18-5)。

方法

诱饵-LexA 融合蛋白的构建

1.将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait。

2. 采用下列 LexA 融合基因和报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：

a.pBait+pMW112(活化测定）

b.pSH17-4+pMW112(活化的阳性对照）

c.pRFHMl+PMW112(活化的阴性对照）

d.pBait+pJK101(抑制/DNA 结合测定）

e.pRFHMl+pJK101(抑制的阳性对照）

f.pJK101单独（抑制的阴性对照）

每种质粒功能的描述，请见表 18-1 和 18-2。

3. 将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(针对质粒组合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(针对质粒组合 f)。将培养板在 37°C 培养 2~3d 以选择含有质粒的转化酵母克隆。
如果克隆在 3~4d 内没有出现，或只有很少量的克隆（<20), 则应重新转化。

4. 制备转化子的母板，从中可按步骤 5~9 描述的那样，对具有 lacZ 和 LEU2 报道子活化表型的特异性克隆进行分析。

活化和抑制活性的鉴定：X-gal 和 Leu2 表型的分析

步骤 5~9 用于测试诱饵-LexA 融合蛋白质的转录激活性，并证实诱饵的融合物不影响 DNA 结合活性（抑制分析的图示请见图 18-9)。对步骤 2 中转化的每种质粒组合，挑选几种单个克隆做分析。这对于某些诱饵的构建非常重要，因为蛋白质表达水平在不同克隆中会有变化，正如活化两种报道子转录激活的表观能力有变化一祥。在第一阶段结束处的替代方案中，给出了一种替代步骤 5~8 的、通过氯仿交叠分析来测试活化的方法。

5. 从 a~f 的每个转化（取自步骤 2) 中，用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格内成为 lcm 长的线。通常可在一个板上形成多达 60~80 条线。将平板在 30°C 孵育过夜。

6.第二天，从两个母板中再划线到下列每个板上：
转化 a~f: 划线到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上
转化 a~c: 划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上

7. 在 30°C 将平板孵育到 4d。

8. 对抑制和激活性进行分析；

a. 对于抑制活性，在划线接菌约 12~24 h 时观察 X-gal 表型。

b. 对于激活性，在划线接菌 18 h 到 72 h 之间观察 X-gal 表型。

c. 在 48 h 到 96 h 之间观察 Leu2 表型。在表 18-7 中给出了具有良好表现的诱饵所应得的预期结果，并总结如下。
（1）最好在接种到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 应当能看出 d+e 转化比 f 的颜色浅。
在接种到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 转化应当是亮蓝色,c 应当是白色，而 a 应当是白或很淡的蓝色。
（2）在接种后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 转化应当同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一样很好生长，而 a 和 c 应当不生长。
（3）最理想的是,a 转化在接种后 96 h 内仍没有明显的生长。

9.基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。

检测诱饵蛋白质表达

10. 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用（在第二阶段中）。

11. 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子（如 pRFHMI)。

a. 用无菌牙签从 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液体培养基中生长。如果带手套，牙签可落入培养管并留在那里，不用担心污染。
b. 在滚筒或其他摇动仪器上 30°C 培养过夜。
c. 早晨，将达饱和的培养液稀释到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培养管中，使初始密度 OD₆₀₀ 约为 0.15。30°C 培养 4~6 h, 直到光密度大约增大两倍（OD₆₀₀约 0.45~0.7)。

12. 转移 1.5 ml 培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞 3~5 min。可见沉淀的体积应为 2~5ul。小心倾去或吸除上清。
一些（尽管不是所有）LexA 融合蛋白随生长静止相启动，表现出可检测的蛋白质水平急剧增加。因而，不需要为了期望増加分析蛋白的产率而使培养进行到饱和。
如果预期要进行一轮以上的分析，在此阶段冰冻双份样品可能会有好处。

13. 加入 50ul 的 2XSDS 凝胶加样缓冲液到离心管中，快速震荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。
样品或即刻用于分析，或在-70°C 冰冻，这样至少可以保持稳定 4~6 个月。

14. 将样品从干冰或-70°C 直接转到 100°C, 并煮沸 5 min。
设定到 100°C 的 PCR 仅最方便，当然也可用水浴或加热。

15. 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心 5~30s 以沉淀大的细胞碎片。加 20~50ul 样品到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16. 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17. 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含 LexA 融合的诱饵的酵母裂解液（请见这一步的注解)。
免疫印迹可按附录 8 描述的进行。LexA 融含物可用计对融合域的抗体来检如果没有，也可用抗 LexA 的抗体替代。
确定一种诱饵蛋白的重要一步是直接分析诱饵是否可被检测到，以及诱饵大小是否正确。在多数情况下，上述两项都是正确的。然而，一些蛋白质（特别是融合域在约 60~80kDa 或更大时）或者合成水平很低，或者在翻译后被蛋白酶剪断。这两种结果都可能导致在文库筛选中出现问題。低水平表达以及在转录活化分析中无表观活性的蛋白质, 可在亮氨酸选择下上调到较高水平，然后突然显示转录活化的高背景。在蛋白质由于发生蛋白质水解而剪断时, 对于仅与较大诱饵的氨基端融合的 LexA 来说，筛选仍然可以进行。