用于蛋白质表达的标签实验2
三、标签的去除
由于蛋白标签可能会干扰目标蛋白质的正常功能，所以在完成其促进溶解或亲和纯化的作用后，标签的去除对于生物学和功能研究很有帮助，对 GST 或 MBP 这样的大标签尤其如此，尽管有一些例子显示融合了标签的蛋白质更易结晶 (Smythetal.，2003)。
大多数用来向目标蛋白质添加标签的商业化表达载体也引入了具有特殊序列的切割位点，使用重组的蛋白内切酶可以去除标签。融合蛋白的亲和纯化完成后，可以使用蛋白内切酶来处理样品以切掉标签，再过一遍亲和柱后标签与重组蛋白会被分开，收集流穿液就会得到目标蛋白质。重组蛋白内切酶通常也会带有亲和标签，这样就可以在酶切反应完成后将其轻松去除。
表 16.3 列出了一些常用的蛋白内切酶。因为肠激酶和因子 Xa 在识别位点的 C 端进行切割，这样就可以将标签和识别位点序列完整去除，因此它们对去除 N 端的标签非常有用。但是，这两种酶有时特异性不是很强, 会在位于其他碱性残基处的次级切割位点进行切割。凝血酶 (thrombin) 是另一个用于去除标签的蛋白酶，它也具有相似的次级切割位点（JennyetaL，2003;LiewetaL，2005)。用凝血酶这样的蛋白酶去除标签，尤其是对于大规模的蛋白质制备, 与其他高特异性的酶相比，它的好处在于价格低廉且效率更高。
PreScission 蛋白酶是一种具有更长的、更严谨识别序列的特异性更高的蛋白酶。它由来自于人鼻病毒-14(humanrhinovirus-14) 的蛋白酶 3C(3Cpro) 和 GS 丁标签组成，GST 标签的存在使得该酶对于移除 GST 标签非常有用。另外一种非常特异且受欢迎的蛋白酶是烟草蚀纹病毒蛋白酶（Kapustetal.,2001), 该酶切割位点后的第一个氨基酸倾向于甘氨酸 (表 16.3), 但也能够容忍其他氨基酸残基，只是切割活性会有少许下降。这使得该酶很多时候都能够将 N 端标签完整去除，在目标蛋白质上不会留下任何多余的残基 (KapustetaL，2002)。可以很容易地自己制备大量的烟草蚀纹病毒蛋白酶，通常该酶会带有一个组氨酸标签以易于纯化及在切割反应完成后将其除去（Tropeaetal.,2009)。
商业公司出售很多类型的烟草蚀纹病毒蛋白酶，它们有的带有别的亲和标签，有的具有更高的活性及稳定性。
烟草蚀纹病毒蛋白酶的一个变种是烟草脉络斑点病毒蛋白酶，其具有不同的识别序列 (Nallamsettyetal.,2004)，能够切开位于两个不同标签之间的切割位点（图 16.1C)。
外切蛋白酶也可以用来去除 N 端标签，如 TAGzyme 系统 (Arnauetal.，2006a，可从 Qiagen 公司购买）。这个方法使用/二肽氨基肽酶 I(dipeptideaminopeptidaseI,DAPase) 来逐步消化 N 端的标签直至一个二肽的终止点。已经设计出了多种类似的系统用于处理不同的序列（Arnauetal.，2006b;2008)。
完整去除 C 端的标签是比较困难的，因为大多数蛋白内切酶只在识别序列的 C 端进行切割。如果有必要完全去除标签，可以设计更加特异的酶切位点，这些位点的识别是以结构为基础的 (如 SUM? 蛋白酶;Malakhovetal.,2004)。或者利用自催化蛋白自剪接兀件（autocatalyticproteinself-splicingelement)(Inteins;SalehandPerler，2006)。这两种切割系统都加上了亲和纯化标签—SUM? 融合系统（Buttetal.,2005;Leeetal.,2008): 包括蛋白质内含子-几丁质结合结构域 (chitin-bindingdomain，CBD; 由 NewEnglandBiolabs 公司将其作为商品化的 IMPACT 系统;Chongetal.，1997) 或蛋白质内含子-聚经基丁酸醋结合蛋白（polyhydroxybutyratebinding) 和类似的蛋白质纯化系统 (Gilliesetal…?2008)。
在一些情况下，标签也可以用化学方法去除。尽管化学切割方法所用试剂价格低廉并且非常有效，但是这些反应需要剧烈的溶剂及导致变性的条件, 所以通常只用于小肽的制备。溴化氰 (CNBr) 可切割甲硫氨酸，当融合蛋白能够被设计成只有一个甲硫氨酸且位于标签和目标肽段之间，可以使用这种试剂 (D6belietal.,1998;FairlieetaL,2002)。另外一种化学切割试剂，羟胺（hydroxylamine)，能够切割天冬酰胺与甘氨酸之间的肽键 (Huetal.,2008) 〇实际应用中需要考虑的问题: 尽管在标签和目标蛋白质之间设计特异性的切割位点相对比较简单，然而标签的有效切割并不会总是发生且也难以预测。对于每一个表达构建体都要用实验检测切割效率。当使用特异性不强的酶时，还要检测可能发生在次级切割位点的切割。通常酶的用量和孵育时间需要摸索以使其最优化。切割效率的最大化对于寡聚蛋白质尤其重要，为了目标蛋白质的高产量，必须去除每一个单体上的标签 (Kenigetal.,2006)。需要切割的序列也需要在空间上能够让蛋白酶接触得到，并且相对地没有形成复杂结构; 在识别序列和目标蛋白质之间引入数个残基的间隔序列或接头序列，或者将不可能形成二级结构的序列放置在切割位点附近, 有时这都可以克服切割效率低下的问题。对于没有亲和标签的蛋白酶来说，柱上切割 (将蛋白酶注入结合有融合蛋白的亲和柱）比批式反应 (batchreaction) 更加有效。
四、结论
很多种蛋白质标签都可以用于促进重组蛋白的表达和纯化。但是，即使有如此庞大的标签库, 结构基因组学的蛋白质制备机构得到可溶性纯蛋白质的成功率也低于 50%(StructuralGenomicsConsortiumetal.,2008)。尽管这些大规模的研究项目设计出/许多很好的策略, 考虑到蛋白质折叠的多样性及它们之间不同的生物化学性质，并没有一套通用的可溶性或者亲和标签适用于所有蛋白质。标签的选择在很大程度上还是依赖于需要表达的蛋白质以及制备蛋白质的目的。在此，我们已经评述了大部分的有效的蛋白质表达标签以及与它们使用相关的问题。
