用流式法（FACS)分离间质SP细胞实验
利用Hoechst33342外流性质分选角膜间质干细胞
用ABCG2表达特性免疫分选角膜间质干细胞
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 2〜4代的间质细胞 |
| 试剂、试剂盒 | HBSS 2FB Hoechst33342染料 lmg ml水溶 碘化丙啶（PI) 2mg ml水溶 维拉帕米 500μg ml水溶 DMEM 2FB 胰蛋白酶 TrypLE:TrypLEExpress或0.25%胰蛋白酶 溶于CMF-SalineG |
| 仪器、耗材 | MoFlo(或与其类似的）高速细胞分选仪 具备350 nm激发能力 |
| 实验步骤 |
(a)胰蛋白酶消化2〜4代的间质细胞。 (b)细胞计数，用DMEM/2FB将细胞稀释至1×106个细胞/ml。 (c）加入5μg/mL (Hoechst33342染料，37℃，90 min，每20 min搅动一次。 (d)对照组细胞在加人Hoechst33342染料前，先加入50μg /ml维拉帕米孵育20min。 (e)染色后，在4℃环境下用HBSS/2FB将细胞洗两遍并离心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重悬细胞。 (f)于分选前加入2μg/ml PI以鉴别无活性的细胞。 (g)无菌条件下分选细胞，高速细胞分选仪，用350nm激发。收集蓝色（670 nm)和红色（450 nm)荧光均减弱的细胞。边群细胞通过上述步骤与死细胞和完全被染料标记的细胞分离开并被收集起来。对照组要确保用维拉帕米先行孵育后使边群细胞消失。
展开 |
