亚硒酸钠用什么培养基
摘要：本研究以实验室四株乳酸菌为研究对象，通过对此四株菌硒耐受能力测定，得到一株硒耐受能力较高的菌株，并对其富硒培养进行了优化，优化结果显示，培养6h后加入亚硒酸钠溶液，使培养基中硒浓度达到8μg/ml，此条件下培养20h后，活菌数可达2.4×10^9cfu/ml，富硒量达到511.2μg/g，在不影响细菌生长的前提下达到了较高的富硒量，为富硒乳酸菌的生产提供了一定的工艺基础。
关键词：乳酸菌，优化，活菌数，富硒量
硒是动物体内一种重要的微量元素，在动物的生长，免疫，繁殖，抗氧化以及激素代谢中有着重要作用。其功能的发挥主要通过参与合成硒蛋白参与动物体的代谢，目前发现的硒参与合成的蛋白有30多种[1]，是哺乳动物体内许多酶活性中心的必需组分，如谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）[2]、脱碘酶(iodothyronine deiodinases)，ID[3]等，过去，硒被认为是一种有毒物质，动物摄入少量硒，会引起中毒甚至死亡，但是随着人们对硒的认识加深发现，日粮中添加适量的硒不仅可以促进动物生长，还对动物肉品质有一定的影响，有机硒的效果显著优于无机硒，并且其功能与维生素E有互补作用，联合使用维生素E可以取得较优的养殖效果。
当前常用的补硒方法是日粮中添加亚硒酸钠，但无机硒利用率低，毒性大，对环境有潜在污染，早在1993年日本就已禁止在动物饲料中添加亚硒酸盐无机硒。有机硒的生物利用率高，毒性小，适口性好，能显著提高动物组织、奶和蛋中的硒水平，提高动物的生产性能[4]。
乳酸菌作为一种常用的微生态制剂菌种，可以通过细菌代谢，将无机硒转化成有机硒，更有利于动物体的吸收利用，在动物饲养方面有着非常好的研究前景，并且，相比于研究较多的有机硒酵母[5]，乳酸菌在抗生素取代方面有着独特的优势。本研究以实验室保存的乳酸菌作为研究对象，通过对其硒耐受能力，亚硒酸钠添加时间，添加量及培养时间几方面的研究，确定了富硒乳酸菌基本的发酵工艺参数，为富硒乳酸菌的制备，提供了一定的理论基础。
1菌种与材料
1.1菌种制备
粪肠球菌：A310，A312；屎肠球菌：A503，A504，均由北京好实沃生物技术有限公司提供。
亚硒酸钠，上海之臻化工有限公司；MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司．其他试剂均为分析纯。
亚硒酸钠溶液，100μg/ml，过滤除菌，保存备用。
1.2实验方法
1.2.1菌种准备
菌种活化：取乳酸菌甘油管，在MRS固体平板划线活化。适当条件培养48h后，保存备用，取活化好的划线平板，挑取单菌落进行斜面划线，适温培养18h，保存备用。
种子液的制备:取活化好的斜面培养物，使用无菌生理盐水清洗斜面菌落，得到菌悬液，将菌悬液以0.2%接种量接种于100ml/250mlMRS培养基，适温培养8h，此为乳酸菌种子培养液。
1.2.2乳酸菌生物量的测定
将培养16h后的乳酸菌培养基以5000 r/min离心10 min，倾去上清液，加入30 mL双重蒸馏水，混合均匀后离心(5000 r/min，10 min)，倾去上清液。如此反复洗涤3次，洗去附着在细胞表面的硒，最后5000 r/min离心20 min获得菌体培养物，将菌体培养物于65 ℃烘干至恒质量，计算每100 mL培养基菌体干质量。
1.2.3菌体培养物中硒的测定
称取约0.1g干菌体样品于带刻度具玻璃塞10 mL试管中，加入混合酸消化液（硝酸-高氯酸(5:1，V/V)0.6 mL，放置过夜。然后将试管置于100℃水浴锅中加热4 h。当试管内黄褐色气体排尽后，取出试管放冷却，加入30%过氧化氢溶液2 mL，继续置于沸水浴中消化，至消化液呈现无色或淡黄色即达终点。取出试管放冷却后，以超纯水定容至10 mL，待上机测定。同时作空白对照。
1.2.4富硒量的测定
采用DAB分光光度法检测硒含量[6]。
1.2.5耐硒菌株的筛选
为了筛选出对硒耐受能力较好的菌株，MRS液体培养基中添加预先灭菌的亚硒酸钠溶液，最终硒浓度分别控制为0μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，最终体积控制在100ml/250ml，使用培养8h乳酸菌种子培养液，以1%接种量接种，适温培养24h后观察活菌数。
1.2.6生长曲线的测定
种子液以1%的接种量接入到MRS液体培养基中，装液量300mL/1000 mL的三角瓶中，37℃下培养。每隔2 h取样，测定乳酸菌菌液的活菌数，绘制生长曲线。
1.2.7最佳硒添加浓度的测定
配制含硒浓度为4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml的MRS液体培养基，种子液以1%(W/V)接种量接种，置37℃培养箱中培养24h。取出测定富硒量以及活菌数，每组重复测定3次取平均值，根据富硒量以及活菌数的差异来确定最佳硒添加浓度范围。
1.2.8最佳硒添加时间的选择
100μg/ml亚硒酸钠溶液，灭菌后备用。种子液以1%(w/v)接种量接种于液体培养基中培养，在4h，6h，8h，10h，12h，14h加入100μg/ml亚硒酸钠溶液，最终浓度控制在8μg/ml，培养至24h。，每组重复测定3次取平均值，按式(1)计算富硒率，根据富硒率及活菌数来确定最佳硒添加时间范围。
1.2.9最佳培养时间的测定
配制含硒8μg/ml的MRS液体培养基，种子液以1%(w/v)接种量接种，分别在培养16h，18h，20h，22h，24h后检测富硒量及活菌数，每组重复测定3次取平均。
2结果与讨论
2.1耐硒菌种的筛选
相同属下不同种菌种对硒的耐受能力存在差异[7]，同时，硒的耐受能力可以用多种指标表示，本实验采用活菌数作为硒耐受能力参考指标，实验结果如图1-4：
由图1-4可知，实验所用四株乳酸菌在低浓度亚硒酸钠条件下培养，均未受到明显影响，当硒浓度达到8μg/ml时，除A312以外三株菌株活菌数均出现了不同程度的下降，且随着硒浓度的增大，活菌数出现明显降低，故选取A312作为接下来研究的实验菌株。
2.2生长曲线的确定
由图5可知菌种在0-2小时处于延迟期，2-10h处于对数生长期，10h后生长速度开始减缓但仍在增长，14h后到达稳定期。
2.3硒添加浓度的确定
由图6可知，随着培养基硒浓度的增加，活菌数与富硒量呈现先增加后降低的趋势，硒浓度在在4-8μg/ml范围内时，菌体浓度与富硒量呈正相关，这说明，在此范围内，硒的添加并未影响菌种的生长，同时，细菌在代谢过程中将无机硒转化成有机硒的能力并未受到抑制，随着硒添加量的增加，菌体生长收到抑制，同时转化硒的能力下降，所以，选取8μg/ml作为亚硒酸钠添加浓度。
2.4亚硒酸钠添加时间的测定
硒的加入时间对微生物的富硒水平有着显著的影响，由图可知，在对数期初期加入亚硒酸钠可以显著提高富硒量，同时，对乳酸菌的生长并未造成抑制，在细菌对数生长后期加入硒，对细菌的生长产生了抑制，可能是亚硒酸钠的加入对某些乳酸菌生长所需的次级代谢产物产生影响，故选取发酵6h作为亚硒酸钠加入时间。
2.5培养时间的确定
在乳酸菌培养6h加入亚硒酸钠，使培养基中硒浓度达到8μg/ml，随着培养时间的延长，富硒量有一定的提升，培养时间超过20h，乳酸菌生长进入到稳定期，随着菌体细胞的裂解，一部分硒释放到培养基中，富硒量减少。所以，选取发酵20h作为富硒乳酸菌培养时间。
3 结论
通过对实验室四株乳酸菌的耐硒能力测定，得到一株具有较高耐硒能力的粪肠球菌，硒浓度达8μg/ml时仍能够很好的生长，并达到较高的活菌水平。当亚硒酸钠添加8μg/ml，添加时间为发酵8h，培养20h后，活菌数可达2.4×109cfu/ml，富硒量达到511.2μg/g，本研究为富硒乳酸菌高密度发酵提供了一定的工艺基础。
参考文献
[1] 刘来利,李元新,王必成. 动物必需微量元素——硒[J]. 甘肃畜牧兽医,2005(2):36-39.
[2] ROTRUCK J T, POPE A L, GANTHER H E, et al. Selenium:biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J]. Science,1973, 179(73): 588-590.
[3] BERRY M J, BAN U L, LARSEN P R. Type I iodothyroninedeiodinase is a selenocysteine-containing enzyme[J]. Nature, 1991,349: 438-440.
[4] 杨善岩，李海龙，狄志鸿．硒元素生理功能及微生物富硒发酵研究现状[J]．食品工业，2013, 34(6): 167－170.
[5] Pérez -Coronaamt, Sānchez -Martínezam, Valderrama M J, et al. Selenium biotransformation by Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus during white wine manufacture: laboratory-scale experiments[J]. Food Chemistry,2011, 124: 1050-1055.
[6] XIA Shukai, CHEN Long, LIANG Junqing. Enriched seleniumand its effects on growth and biochemical composition in Lactobacillus bulgaricus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007,55(6): 2413-2417.
[7] 黄高明. 富硒乳酸菌种的筛选[J]. 广州食品工业科技, 2004, 20(4):33-35.
