高性能微球在多肽药物分离纯化中的应用（三）
「 色谱填料孔径对多肽分离纯化的影响 」
除了体积排阻色谱外，其它色谱分离机理都离不开样品与色谱填料表面的作用。
色谱填料孔径大小、分布及比表面积对多肽分离性能也有重大的影响，对于分子量小于1000的多肽样品，一般选择孔径在100Å 以下的就可以。
对于大多数分离模式来说有效的比表面积越大，载量越大，但有效比表面积取决于目标样品的分子量、孔径大小及孔容积。
这里指的有效比表面积是针对特定物质分离条件下有用的孔道比表面积总和，无效的比表面积是指孔径小于一定尺寸，目标分子不能进出，在分离过程这些小于一定尺寸的孔道所产生的比表面积不能起到分离作用，因此要根据分离的样品的分子量来选择合适孔径的色谱填料。
如胰岛素分子量大概在6000左右，如果使用C8反相硅胶色谱填料分离纯化，一般选用粒径10微米，孔径100Å左右的色谱填料；
如果选用孔径小于80Å的C8硅胶色谱填料，虽然测得该填料比表面积比孔径100Å色谱填料要大，但该色谱填料分辨率和载量会比100Å色谱填料低很多；
如果选择孔径过大的色谱填料，如200Å的色谱填料，该填料比表面积比100Å的相对会减小，导致载量降低，同时孔径大的硅胶填料机械强度也比孔径小的机械强度要差。
对于聚合物色谱填料需要的孔径会比硅胶要大，一般300Å聚合物色谱填料就相当于100Å硅胶色谱填料。
如果孔径保持一致条件下，孔容积越大，比表面积也越大，单位体积的硅胶含量越少，因此机械强度则越差。
在其它条件不变，一般选择有效比表面积越大的填料越好，这样载量大，机械强度好。一般来说孔容积越大载量越大，分离效果也越好，但孔容积越大，机械强度越差。因此对于一般多肽分析和分离用色谱填料孔容积要求在0.5-1.0ml/g左右，如果用于体积排阻利用分子筛性质的填料孔容积要求会大于1.3ml/g。
另外小于50Å的微孔的存在对部分样品组分的分离效果有影响，因此在做硅胶表面键合之前最好把这些微孔封掉。
常规色谱填料粒径大小分别有1.7、3、5、8、10、12、15、20、30、40、50微米；常规孔径可选择0.05nm（50Å）、0.1nm（100Å）、0.12nm （120Å）、0.17nm （200Å）、0.3nm （300Å）、0.1nm（500Å）。因此要根据目标多肽样品的分子量选择合适孔径色谱填料。
03
「 填料粒径大小及均一性对多肽分离纯化的影响 」
色谱填料的粒径主要影响填充柱的的柱效和背压。填料粒径越小，填充柱的柱效越高，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度。填料粒径越小，柱压也越高，因此对色谱系统的要求也越高，设备投资也越大，小粒径色谱填料的价格也高。
因此用于工业制备的色谱填料颗粒粒径往往在10微米以上, 常规HPLC色谱柱硅胶填料粒径在3-5微米之间, 而用于UPLC 的色谱填料在2微米以下。
选择色谱粒径大小要综合考虑分离效率和成本。下图是用纳微科技UniPS系列不同粒径聚合物色谱填料（粒径分别为10、20、30微米）对多肽、蛋白等分离效果的影响。
不同粒径的色谱填料对多肽和蛋白质分离效果的对比
除了粒径的大小外，色谱填料的粒径分布情况也是色谱填料性能的重要参数。在高效液相色谱分离过程中，流动相流过的通路主要是粒状填料间的间隙，而填料粒径大小、均一性及填充柱床紧密程度的不均一性，都会使填充柱产生多路径效应。
使溶质分子在填充柱床中的流动路径和保留时间发生变化，导致色谱峰变宽，从而影响溶质分子分离效果。
当色谱微球填料粒径分布较宽，相同的溶质分子流过色谱柱时，在填充柱床内产生不同的通路，导致经过的路径长短不同，相应的保留时间也有所不同，使色谱峰展宽，理论塔板数变小，柱效降低。
当使用粒径均一的微球填料填充色谱柱时，因其紧密程度一致，有效减少了填充床的多路径效应，使溶质分子流过色谱柱时经历的路径长度基本相同，相应的保留时间也较一致，使色谱峰宽变窄，理论塔板数升高，从而获得较高的柱效（粒径均一性对分离柱效的影响如图8所示），在小分子及多肽的反相分离中获得较好的分离效果。
粒径均一性对分离柱效的影响
用于多肽药物分离纯化的色谱填料要求极高，因此制备技术壁垒高，世界上真正具备规模化生产能满足色谱需求的多分散多孔球形硅胶的厂家只有Kromasil, Daisol，Fuji及Merck等四家。
而可以生产聚合物色谱填料的厂家主要有美国GE，日本Tosoh 等少数公司。目前大多数市场上的色谱填料无论是硅胶基质还是聚合物基质粒径分布都较宽，因此开发单分散色谱填料的技术一直是业界的发展目标，也是该领域的技术难题。
纳微科技致力于研究单分散微球材料的制备和应用的高科技企业，不仅成功地开发出单分散多孔聚合物微球，而且成为世界第一家开发出单分散硅胶填料的大规模生产技术，并获得国家发明ZL。
先进微球材料是多肽药物发展的基础，无论是用于多肽固相合成的微球载体还是用于分离纯化和检测的色谱填料都离不开高性能微球材料，微球材料制备技术的进步会促进多肽药物产业的发展。
苏州纳微科技股份有限公司（简称纳微）专门从事高精度、高性能和高附加值微球材料研发和生产的国家高新技术企业，致力于建设世界领先的纳微米球精准制备和应用平台，是世界上能提供最多微球品种与规格的公司之一。
纳微拥有单分散色谱填料的精准制备技术、表面功能化技术和规模化生产能力；产品涵盖硅胶正相、反相、HILIC、手性填料，聚合物反相、离子交换、疏水层析、亲和层析（ProteinA、金属螯合、苯硼酸）、固相萃取、凝胶渗透色谱及特殊功能填料；还提供色谱柱、磁珠、标准颗粒、分析检测、分离纯化实验技能培训及分离纯化整体解决方案。纳微已实现大规模出口高性能色谱填料到欧、美、日、韩等国家和地区的国际知名制药和色谱企业，成为世界色谱行业的领军企业之一。
纳微承担国家战略性新兴产业发展专项（2013年蛋白类生物药和疫苗发展专项）、国家科技支撑计划项目课题，建成江苏省纳微米球材料工程中心及工程技术研究中心，成立苏州纳微先进微球材料应用技术研究所，已获得国家发明ZL19项，获1项国家重点新产品和4项江苏省高新技术产品。
