一种高性能时间分辨荧光微球的制备方法和应用与...-2
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的时间分辨荧光纳米微球具有荧光强度高、空间位阻效应低、稳定性好等特点，基于该微球开发的时间分辨荧光免疫层析技术，具有检测灵敏度高、线性范围宽、精密度高、样本适用范围光等优点，可实现待测物质的超敏、快速、定量检测和分析。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1一种可提高稳定性和荧光强度、降低空间位阻效应的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，包括以下步骤：(1)高稳定性聚苯乙烯纳米微球的制备取50mm苯乙烯单体和2.5mm丙烯酸单体溶解于50ml含1.5mm十二烷基磺酸钠和8mm葡聚糖(Mw：25000)的去离子水中，加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀，然后用高纯氮气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至75℃，加入3ml0.18mm的过硫酸钾，密封隔氧搅拌反应12h后，降至室温，然后将反应液用whatman2v滤纸(孔径8μm)过滤，过SephadexG-200分子筛柱，收集最先洗脱下来的组分并浓缩至100mg/mL的浓度，加入0.05％的迭氮钠4℃保存。通过透射电镜测定，所制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为210±5nm，表面电荷SurfaceCharge(μeq/g)为189.58，羧基密度ParkingArea为(sq.A/grp)为22.8，为高羧基密度微球。此步骤，通过调节加入十二烷基磺酸钠的浓度，可获得不同大小粒径的聚苯乙烯微球；通过调节加入丙烯酸的浓度，可获得不同表面羧基密度的聚苯乙烯微球。(2)不同离子掺杂铕离子螯合物的制备用甲醇分别配制10ml浓度为0.1M的三氯化铕、三氯化镱、三氯化镥、β-二酮(β-NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)溶液，混匀密封保存。取1.5ml三氯化铕溶液(0.1M)、0.15ml三氯化镱溶液(0.1M)、0.05ml三氯化镥溶液(0.1M)混合均匀，再加入5mlβ-二酮(β-NTA)和5ml三辛基氧化膦(TOPO)溶液，强力混匀并静置螯合过夜。(3)高荧光强度纳米微球的制备取1ml步骤(1)中制备的210nm的高稳定性聚苯乙烯微球，加入10ml去离子水和丙酮混合液中(v/v＝1:1)，37℃匀速搅拌溶胀12h，然后加入0.8ml步骤(2)制备的不同离子掺杂铕离子螯合物，37℃恒温搅拌反应24h，最后通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，过SephadexG-200分子筛柱，收集最先洗脱下来的组分并浓缩至10mg/mL的浓度，加入0.05％的迭氮钠4℃保存。(4)荧光微球表面的去空间位阻效应修饰取1ml步骤(3)中制备的荧光微球，溶于4ml0.05MpH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶液中，100w超声处理1min，然后缓慢加入100ul15mg/mL的碳二亚胺(EDC)和200ulN-羟基珀酰亚胺(NHS)，室温匀速搅拌活化15min后，15000RPM离心10分钟，收集沉淀，用0.05MpH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤离心2次。将活化的荧光微球复溶于5ml0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，加入20ul0.1M分子量为5000的NH2-PEG(1000)-COOH溶液，室温匀速搅拌30min，15000RPM离心10分钟清洗2次，最后用5ml0.05MpH6.0的硼酸缓冲液复溶，加入0.05％的迭氮钠4℃避光保存。实施例2不同浓度和不同分子量的葡聚糖对微球稳定性的影响参照实施例1，其他条件和参数均不做调整，仅改变步骤(1)中葡聚糖的加入的量及分子量，然后将最终制备的荧光微球用30％的甲醇稀释至1mg/ml，静置过夜。20000RPM离心30min，取100ul上清溶液加入微孔中，然后采用PerlinElmerLifeSciences公司生产的AutoDELFIA-1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪进行测试，如上清中荧光强度越强，则说明微球中的荧光物质泄漏越严重，表明微球的稳定性越差，反之则说明荧光微球的稳定性越强，抗基质的干扰能力也越强。表1不同浓度和不同分子量的葡聚糖对微球稳定性的影响由表1可以看出，相比不加葡聚糖的方案，加入葡聚糖后，荧光泄露的程度均有不同程度的下降，说明葡聚糖的网状结构可以提升微球的稳定性，且最佳的方案为葡聚糖分子量为25000，加入的浓度为8mm，在极端条件下荧光物质的泄露率可降低至不加葡聚糖的12.3％。实施例3不同离子种类及其浓度的掺杂对荧光强度的影响参照实施例1，其他条件和参数均不做调整，仅改变步骤(2)中三氯化镱和三氯化镥加入的量，然后将最终制备的荧光微球。用纯水稀释至1mg/ml，取100ul加入微孔板中，然后用PerlinElmerLifeSciences公司生产的AutoDELFIA-1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪进行测试，如荧光强度越强，则说明螯合物的荧光增强效果越好，检测灵敏度也会随之增强；反之则说明螯合物的荧光增强效果越差，检测灵敏度也会降低。表2不同离子种类及其浓度的掺杂对荧光强度的影响离子掺杂种类及比例荧光微球荧光强度Eu3+：β-NTA：TOPO＝5：50：5090000Eu3+：β-NTA：TOPO＝10：50：50150000Eu3+：β-NTA：TOPO＝15：50：50180000Eu3+：β-NTA：TOPO＝20：50：50160000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：0.5：50：50200000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：50：50220000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：3.0：50：50220000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.1：50：50280000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.5：50：50350000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：1.0：50：50320000国外进口商品化时间分辨荧光微球1120000国外进口商品化时间分辨荧光微球2150000从表2可以看出，通过同时掺杂镱离子和镥离子，可以大幅提高荧光微球的荧光强度，最佳的比例为Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.5：50：50，通过此方案开发的微球荧光强度远高于进口的同类产品。
上述国外进口商品化时间分辨荧光微球1为美国BangsLaboratoriesinc公司的产品，货号为：FCEU002，粒径为：190-210nm；上述国外进口商品化时间分辨荧光微球2为美国ThermoFisher公司的产品，货号为：93470520010150，粒径为：200nm；实施例4不同分子量NH2-PEG(N)-COOH修饰微球表面对空间位阻效应的影响参照实施例1，其他条件和参数均不做调整，仅改变步骤(4)中NH2-PEG(N)-COOH的分子量，然后将最终制备的荧光微球，参照CN201510089616.5“一种能同时检测藻毒素MC-LR/RR/YR的荧光定量试纸条及其制备方法和应用”中所述的方法，标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体，制备黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条，并测定其检测灵敏度。如灵敏度越高，则说明荧光微球的空间位阻效应越低，反之则说明荧光微球的空间位阻效应越高。
表3不同分子量NH2-PEG(N)-COOH修饰微球表面对空间位阻效应的影响NH2-PEG(N)-COOH分子量灵敏度不修饰NH2-PEG(N)-COOH0.284μg/kg4000.258μg/kg8000.231μg/kg20000.087μg/kg50000.025μg/kg100000.036μg/kg200000.239μg/kg从表3可以看出，通过修饰分子量在800以下的NH2-PEG(N)-COOH，对提高检测灵敏度几乎无帮助，分子量在2000-10000范围内时，灵敏度有比较大的提升，且最佳的分子量为5000，灵敏度较未修饰NH2-PEG(N)-COOH可提升约10倍。当分子量超过10000时，灵敏度反而有下降的趋势。实施例5不同荧光微球标记的黄曲霉毒素B1荧光免疫层析试纸条技术性能的对比参照CN201510089616.5“一种能同时检测藻毒素MC-LR/RR/YR的荧光定量试纸条及其制备方法和应用”中所述的方法，其他条件均不变，仅改变黄曲霉毒素B1单克隆抗体标记所使用的微球，制备黄曲霉毒素B1荧光免疫层析定量检测试纸条，并测定其重要技术性能参数，结果如下：表4不同微球标记对产品最终性能的影响从表4中可以看出，采用本方案所制备的微球，其产品各项指标的性能均远优于进口同类产品，可大幅提高检测产品的灵敏度，提升产品的稳定性，降到不同基质的结果的干扰。上述国外进口商品化时间分辨荧光微球1为美国BangsLaboratoriesinc公司的产品，货号为：FCEU002，粒径为：190-210nm；上述国外进口商品化时间分辨荧光微球2为美国ThermoFisher公司的产品，货号为：93470520010150，粒径为：200nm；本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
