概述荧光原位杂交位点数目及检测目标
在FISH 技术基本确立之后,FISH 不仅用于单基因或核酸检测,FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测,从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测,并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。早期的探针较大,是通过载体的增殖、缺口平移法、体外转录法和随机引物DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆。然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景,采用未标记的核酸进行预处理使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题,同时也使得研究者扩大了检测目标,实现了整条染色体染色。在细胞遗传学上FISH 技术在染色体分析方面也因此得到了显著的提高。如通过比较基因组杂交（Comparativegenomic hybridization）用于检测染色体区域的缺失和重复。大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号,混淆染色体上基因的检测,就需要剪切成小片段<200核苷酸。现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得FISH技术的检测要求越来越低,灵敏度越来越高。精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术。随着检测目标越来越小,FISH技术已用于隐蔽的亚端粒核型基因重排和精确的染色体作图及单拷贝mRNA的检测。
FISH 检测范围的扩大,使得FISH 技术的应用在20 世纪90 年代急速增长。由FISH 技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。首先是采用不同的荧光素来检测多位点,如双色荧光用于检测特异的核酸序列,每一条染色体、基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH 应用范围。译码方案主要是针对色彩比例,即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。前述的每一种方法,或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12 个。采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH 技术多位点检测的里程碑。尽管可以采用多种方法观测到mRNAs,但是FISH 对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。
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