第二阶段  筛选一个相互作用子

材料

缓冲液和溶液
将贮存液稀释至适当的浓度

二甲基亚砜（DMSO)

乙醇
可选择，请参见步骤 9。

冻存转化体用的无菌甘油溶液
65% 无菌甘油
0.1mol/LMgS0₄
25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（无菌）
TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸锂
TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸锂（无菌）

核酸和寡聚核苷酸

载体 DNA
剪切处理的鲑精 DNA 为典型的常用载体。髙质量的 DNA 是非常重要的。使用低质量的制品可能降低 1~2 个数量级的转化频率。生产髙质量鲑精 DNA 的简便方法请参见 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可选择许多公司出售的这种商品。

相互作用筛选文库

培养基

CM 选择培养基
利用表 18-3 估计所需培养基的量，根据表 18-8 制备所需的选择培养
无氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸铵，配制时每升培养基中应加入 5 g 硫酸铵。

酵母选择 X-gal 培养基
1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至 55°C。
2. 在另一个瓶于中，将 7 g 磷酸氢二钠和 3 g 磷酸二氢钠溶于 100 ml 蒸馏水中，高压灭菌。
3. 将两种髙压灭菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 浓度为 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 铺制平板。

离心机和转子

Sorvall GSA 转子或等同物
Sorall RT6000 离心机和 H1000B 转子或等同物

专用设备

选择培养基用培养极（24 cmX24 cm)(见表 18-3)
这些培养板非常昂贵，但是可以重复使用很多次（见步骤 9)。

Falcon 管（50 ml，无菌）

玻璃珠（直径 0.45 mm, 无菌；Sigma)
可选，请见步骤 9。

加热块，预设至 42°C

微量滴定板（96 孔）
可进，请参见步骤 21。

多道移液器或接种多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)
可选，请参见步骤 21。

用于多菌落转移的蛙形器可以购买或自己制造也很容易；蛙形器的所有辐条都有一个平坦的表面且辐条末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通过高压或乙醇灼烧来灭菌。

载体和细菌菌株或酵母菌株

携带表达诱饵蛋白质和 lexAop/lacZ 报道子的载体的酿酒酵母候选菌株（来自第—阶段）。



方法

转化文库

1. 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，30°C 摇动过夜培养。
重要：应该在用文库重新转化之前 7~10d 内，将诱饵蛋白和 lexAop-lacZ 报道子质粒转化到酵母中。在整个试验过程中始终保持无菌条件非常重要。

2. 稀释 20 ml 的过夜培养物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中，以使稀释后培养液的 OD₆₀₀ 约为 0.10~0.15。在旋转摇床上 30°C 摇动培养，直到该培养物增殖 1~5 倍，OD₆₀₀ 达到 0.50 左右。

3. 把培养物转移至 1 个 250 ml 的无菌离心瓶中，室温下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心 5 min。移去上清，加入 30 ml 无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。

4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 转子 2500~3000r/min) 离心酵母细胞 5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸锂的 TE(pH7.5) 中。

5. 在 30 个 1.5 ml 的无菌小离心管中分别加入 1ug 的文库 DNA 和 50ug 刚刚变性的载体 DNA。马上在每个小离心管中加入 50ul 的酵母悬浮液（来自步骤 4)。
—个成功的转化试验，每微克文库 DNA 应该产生约 105 个转化子。使用小体积的 DNA(最好毎个转化管中少于 10ul) 通常可以提高转化效率。
平行地进行多份小量的酵母转化有利于喊少污染的概率，而且这种方法与在较少试管中采用较大体积相比，经常可以得到显著更髙的转化效率。每份感受态酵母细胞悬泮液中不要加入过多的转化文库 DNA, 否则每个感受态细胞可能吸收多个文库质粒，使后面的分析复杂化。

6. 在每管细胞悬浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸锂的无菌 TE(PH7.5), 轻轻翻转试管若干次使混合（不要振荡)，30°C 培养 30~60 min。

7. 每个试管中加入 40ul DMSO, 翻转混匀悬浮液，在 42°C 的加热块上加热 10min。

8. 按照下述步骤将转化混合物铺平板：

其中的 28 管只用于产生转化子

a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 选择平板上。
b. 将细胞涂匀，并将平板置于 30°C 孵育直到菌落出现。
每个 24 cmX24 cm 平板需要 250~300 ml 的培养基，应该在倒制平板后室溫干燥 1~2d 再使用。为了减少污染的机会，倒制平板后需用火烘烤平板表面。一些研究人员采取了另外的处理方法：打开平板，翻转盖子放置在标准组织培养超净台内，紫外线照射约 10 min。

剩余 2 管用来评价转化效率

a. 从每个管中取 350ul 混合物加却 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平扳上。
b. 铺平细胞，30°C 培养平板直到菌落出现。
c. 吸取每管中剩余的 40ul 混合物用无菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1:10 稀释（至少 3 次)。
d. 每份稀释液吸取 100ul 铺在 100 mmCM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 培养平板直到菌落出现。
分析稀释度能够大致估计所得转化子的数目。100 mm 指示平扳上预测增加的转化子菌落数目偶尔与 24 cmX24 cm 平板上的数目有显著的不同，尤其是不同批次的平扳之间。一个成功的转化实验中每个大平板上应该产生 20000~40000 个菌落。

初级转化子的收获和富集

步骤 9~14 提供代表全套初级转化子的冻存物，可用于后面的筛选。在这个实验中，从初级转化子（约 10⁶ 个细胞）制备同质的细胞悬液，每一份都可以用来在选择培养基上进行平板筛选。这项技术代表了更加常规的转移酵母的方法（例如：复制平板培养），它转移了如此大量的细胞，以至于在选择培养基上可以观察到某种程度上导致虚假背景的细胞生长。如果在平板上观察到可见的霉菌斑或其他的污染，那么在收获文库转化子之前，用无菌刀片小心地切去污染物及其周围部分。
在步骤 9 中，第一种方法（揺动法）操作起来很快，可以在同一天进行文库的诱导和选择培养基上的筛选，它也缩短了平板打开的时间，从而避免源于空气传播的霉菌和细菌的污染。大约三分之一的酵母细胞悬浮液将留在平板上；然而正常情况下所使用的量不超过收集悬液的 2%，所以保证酵母菌落以大致相等的概率从平板上洗脱是很重要的。步骤 9 中的第二种方法（刮擦法）节省试剂，而且可以方便地在已经切掉霉菌和污染物的平板上使用。

9. 使用下列方法之一收获文库。

1) 通过摇动法收获文库

a. 分别在 5 个含有转化子的 24 cmX24 cm 平板上倒入 10 ml 无菌水和大约 30 粒无菌玻璃珠。

b. 把 5 个平板叠放在一起，紧握平板，猛烈地摇动平板直至菌落重新悬浮（1~2 min)

c. 用无菌移液管从每个平板中吸取 5 ml 酵母悬液（倾斜平板) 把细胞悬液集中在 50 ml 的无菌锥形管中。

d. 继续下面的 5 个平板，重复步骤 a~c。连续从 30 个平板中收获酵母细胞，结果得到总体积为 150 ml 的酵母悬液，保存在 3 个 50 ml 管中。
相同的玻璃珠可以转移到新的平板中，也可使用新的玻璃珠。同时洗脱的平板可以超过 5 个，只要手可以握住摇动即可。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后，弃去残余的琼脂，冲洗平板，用乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射 10 min, 存储备用。

2) 通过刮擦法收获文库

a. 戴着手套，把 30 个含有转化体的 24 cmX24 cm 平板放在 4°C 环境中使琼脂变硬（通常需要 2 h 甚至过夜）。

b. 把一个显微镜载玻片在乙醇中浸泡，然后灼烧消毒，用这个玻片轻轻地把酵母细胞从转化平板上刮至 50 ml 的锥形管中。不断地重新灼烧玻片或换用新的玻片（每 5~10 个平板)。
全部 30 个平板上的细胞通常汇集在一或两个 50 ml 锥形管中。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后弃去残余的琼脂，冲洗平板，乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射 10 min，存储备用。

10. 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌 TE(pH7.5) 或无菌水至 40~45 ml, 振荡或翻转试管悬浮细胞。

11. 使用台式离心机 1000~1500 g(使用 Sorvall H1000B 转子 2200~2700r/min) 室温下离心试管 5 min, 弃去上清。

12. 重复步骤 10 和 11。

第二轮洗涤后，源自 1.5X10⁶ 个转化体的细胞沉淀总体积应为 25 ml。

13. 重新悬浮紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。

14. 分别转移1ml 的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70°C 冻存（至少 1 年内细胞保持稳定）。
如果直接在选择培养基上进行平板培养（完成需要 5 h)，留一份不要冻存，进行下面的步骤。假设未冻存培养物的存活力 100%,—般情况下，酵母冻存时间少于一年，预期存活力将大于 90%。如果出现意外情况（例如：特别是在选择培养基上铺平板培养冻存细胞后没有得到菌落)，通过在 CM(GlU)-Trp-His-Ura 上进行一系列的有限稀释测量冻存细胞的存活力。

相互作用蛋白的筛选