变性凝胶电泳实验——基本方案
DNA序列测定的准确性很大程度取决于测序产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上的分离度。一般说来,用于DNA测序的凝胶需要长40 cm,厚度均匀,含有4%~8%丙烯酰胺和7 mol/l 尿素。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 制作每块凝胶时,首先要用肥皂及水小心严格地清洗两块30 cm×40 cm的前后玻璃平板,用去离子水冲洗后晾干,用喷射洗瓶喷10%乙酵或异丙醇使平板湿海。
5. 按厂商指南用0.2~0.4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层,注意垫片与平板的边、底压紧对齐。
7. 立即灌胶,用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液,避免吸入气泡,让短平板朝上, 并使凝胶平板夹层与臬面成45度角,沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间,其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。
14. 凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液,使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中,放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。
16. 将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层,使其齿部仅可触及凝胶,用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔,以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
17. 加样前,在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳,使凝胶预热,即在1 700 V,70 W 恒功率下电泳约30 min。
19. 在甲酰胺/染料溶液中的样品,盖好盖子,在95℃加热2 min,然后置于冰上,每孔加 样2~3 μl 测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。
27. 一旦平板分离后,取去另一边的垫片及除去凝胶周围多余的聚丙烯酰胺碎片。
28. 如果样品含32P或33P,固定步骤可用可不用。如果样品含33S,直接将凝胶连同玻璃平板一起放入浅托盘中,轻轻覆盖一层约2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液,浸泡10~15 min,不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。
29. 将疑胶重新置于平板上,靠吸力或重力除去固定液注意保持凝胶处于平极的中央, 小心从托盘中将平板连同凝胶取出,放在工作平台上。
33. 从干胶上揭去保鲜膜,将干胶放在X光曝光盒中,Kodak XAR-5X光胶片直接与凝胶接触,室温放射自显影,经足够时间曝光后(一般需过夜)取出X光胶片并冲印。 收起 |
其他 | 变性聚丙烯酰胺凝胶中相对于示踪染料的寡核苷酸的迁移 |