定点诱变实验——基本方案
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。
2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓为1 ng/μl。
3. 合成寡核苷酸引物，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，重悬于500 μl TE缓冲液中，在A260吸光度，调整浓度至500 ng/μl。 4. 往两个500 μl 量离心管加入下列试剂，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2： 10 μl 10×扩增反应缓冲液 1 μl 寡核苷酸1或2
5. 按下列条件在自动热循环仪上扩增20~5个循环： 最后一个循环结束后，在72℃保温10min。 6. 取4 μl进行非变性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以验证扩增反应已产生了预期的 产物。
7. 吸去石蜡油，并用氯仿抽提1次以去掉剩余的石蜡油，酚抽提和乙醇沉淀。 |
| 其他 |
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