层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作(3)
柱层析的基本装置及基本操作
目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
(1)柱层析的基本装置
柱层析的基本装置，如图2－21 。
(2)柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤：
①装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50，凝胶柱可以选1:100～200。然后将柱子洗涤干净。
将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5～1mol/L)、碱(0.5
~1mol/L)、盐(0.5~1mol/L)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm 高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液，吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。
②平衡
柱子装好后，要用所需的缓冲液 (有一定的pH
和离子强度)平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理，这方面的内容将会在离子交换层析中加以介绍。
③加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于 20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。
④洗脱
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH
值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如图2－22。我们可以通过下式计算得到流经层析柱的洗脱液中盐浓度：
C = CB－( CB－CA)( 1－V2 / V1)B1 / A1
式中： C：流经层析柱的洗脱液的盐浓度；
CB：梯度混合器中B 瓶的盐浓度(不搅拌)；
CA：梯度混合器中A 瓶的盐浓度(搅拌)；
B1：B 瓶的横切面积； A1：A 瓶的横切面积；
V2：流经层析柱的洗脱液体积； V1：梯度洗脱液总体积。
图 2－22 柱层析中形成洗脱液梯度的三种形式示意图
A：混合液(低浓度盐溶液)；B：储液瓶(高浓度盐溶液)
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整
(可以用正交试验或优选法)，才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。
⑤收集、鉴定及保存
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1mL~5mL/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL
/
管，这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冷冻干燥得到干粉，在低温下保存备用。
⑥基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生
许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用。各种基质的再生方法可参阅有关文献。
