质谱沙龙第十四期活动报道
2008年11月30日下午，质谱沙龙第十四期活动在中国食品发酵研究院会议室举行。来自发酵研究院、清华大学、二炮总医院、朝阳医院、北大医学院、北医三院、安贞医院、空军总医院、中科院植物所、中科院过程工程所、AB公司的各位专家、老师、学生20余人。
食源性低聚肽简介及其功效成分探索
首先由中国食品发酵工业研究院 功能食品中心的金振涛 介绍他们的一个课题，展示了思路、研究方法、遇到的问题、解决方法、设想等等。
中国食品发酵工业研究院功能食品中心 金振涛：食源性低聚肽简介及其功效成分探索
金老师首先介绍了概念：食源性低聚肽是以动、植物食物蛋白源为原料，经过生物酶水解、分离、精制得到的小分子蛋白（肽）的混合物，是存在于动物、植物、微生物体内的天然生物活性肽和蛋白质降解后产生的外源性生物活性肽，其次阐述了食源性低聚肽的生理特点和应用优势。目前，与中国食品发酵工业研究院技术合作的企业所生产的低聚肽的种类有：植物肽、海洋肽、动物肽及其它低聚肽。有些研究者开展了食源性低聚肽的生理活性研究，如临床测试、动物实验、体外实验等；而金所在的课题组正在进行食源性低聚肽的功效成分研究，这次的报告也主要介绍了他们的一些探索性的尝试。（笔者注：听起来有点像中草药的功效成分研究，所以可想而知研究的难度是很大的）。
下面的介绍中，都以海洋胶原肽作为研究对象，他们采用了几种方法：各级色谱逐步分离、肽指纹图谱鉴定、LC-MS-MS鉴定。
1、技术路线一：各级色谱逐步分离
该法是当前研究低聚肽功效成分最常规方法，文献中最多采用，已相继报道出上百种具有抗氧化、降血压等不同功能的活性单体。经过如下图所示的实验流程，发现：胶原肽分子量整体在1000Da以下，且分布非常集中，成分复杂，用分子排阻色谱无法实现有效分离，用离子交换色谱能实现部分分离，但上样量较小，较难收集大量洗脱峰组分，不利于活性测定。
2. 技术路线二：肽指纹图谱鉴定
文献已报道多种活性结构，他们提出了食源性低聚肽功效成分研究的新思路——肽指纹图谱鉴定。即通过高效液相色谱分离优化出最佳肽谱，之后以文献中报道的活性肽结构做为标准品来反复比对，从中找出具有高降血压、抗氧化、降血脂等功能的活性片断。目前，他们用标准品，分别鉴定了R-GSH、L-肌肽，并证明具有较高的相似度，正在准备开展MALDI-TOF的实验。在这种探索中，他们也提出了几点思考和疑问：比如当前用HPLC峰纯度指数鉴定的可信度，以后收集液相峰用MALDI-TOF鉴定的可行性，胶原肽极性较大难分离，二维液相分离的可行性等问题。
3. 技术路线三：LC-MS-MS鉴定
质谱沙龙活动曾有两次介绍了iTRAQ试剂在氨基酸鉴定中的应用，因此，研究小组也探索用该方法，筛选和鉴定游离的氨基酸和小肽（如二肽），二炮医院的李鹏飞老师在其中也合作进行了一些探索，初期探索以二肽作为研究对象。他们的方案是：
- 将20种氨基酸任意组合列出400个二肽，整理成表，以分子量由小到大排列，20个一组分成20组。
- 每一组分别通过二级质谱进行分子量筛选（115，145+肽分子量），找出可能存在的分子量以及一些结构信息。
- 将找到的可能二肽结构与已知活性肽对比，得出可能活性肽信息。
- 进一步探索其结构。
在应用该方法时，他们还改进了方法，比如原来用MRM，希望在子离子中可以检测到除115外的更多离子，但比较困难；后来从MRM筛选改为母离子扫描，通过质量的差值（母离子-115）来推断大概是何种二肽。
这个工作还处于探索阶段，所以演讲人在这里也向大家征集意见，到场的几位专家给出了很多建设性的意见。比如，关于如何从动物凝胶里提取具有生物活性的多肽，来自于过程工程所的张贵锋 博士介绍了三种方法。第一种，把各种混合的东西分开，但难度很大，因为胶原蛋白降解后亲水性很强，用反相分离时一个色谱峰中还有很多未分开的组分；所以最好是用多柱多维，但工作量很大，因为需要分离出甚至几千种物质，再分别测定其生物活性。第二种，是用细胞实验的方法。第三种，是借助生物信息学的研究工具，从胶原蛋白的序列找出结构域跟已知功能蛋白一样的，作一个功能配体亲合连在介质上，做成亲合层析介质，再把凝胶蛋白过柱、吸附、脱附、洗脱，然后再用质谱测或生物活性鉴定。张博士的实验室曾利用亲合柱的方法简化候选的多肽，比如可用纤维连接蛋白连接到介质上作为亲合介质，得到了6种多肽（2006年质谱学报增刊 “阿胶中特异性多肽的分离与液质联用分析”）。
相关文章：1、阿胶中特异性多肽的分离与液质联用分析 2、高效液相色谱质谱联用法识别明胶动物来源
而如果想采用第一种方法，也可以使用张博士所在的实验室开发的多维层析系统，共有12根柱子，可切换，使混合物得到更好地分离。张博士也诚恳地指出，现在报告者课题组面临的主要问题，主要是如何在复杂的体系中筛选有活性的肽，而表征相对是靠后的工作，也不是特别困难的。
也有专家们指出，二肽、三肽用MALDI-TOF会比较难，但可以考虑用离子阱液质，最近的ETD解离技术也可以试试。也有人提出可以提高质谱的分辨率，去更精确地找到母离子扫描中一级质谱的母离子的质量，从而推断是哪种二肽。
这里，笔者也衷心祝愿他们的研究能够尽快地取得突破性进展。
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如何提高灵敏度——液质联用高技术在药物代谢动力学中的应用
很多质谱的用户最初关注的是如何会操作、使用仪器；在熟悉了以后，更多地会关注在实际工作中如何提高灵敏度。所以，二炮医院的李鹏飞老师，为大家总结介绍了一个非常适用的报告，这个报告的主要思想来源于吉林大学的王英武老师，一些原理是普适性的，但优化的主要目标是面向做药代动力学的用户。
二炮总医院药剂科 李鹏飞：如何提高灵敏度——液质联用高技术在药物代谢动力学中的应用
首先，从紫外和质谱检测器各自的原理入手，介绍了质谱的选择性，比如质谱可以有XIC（提取离子流色谱图，可以分离出在色谱同一时间出峰，但质量不同的离子）。然后从4个方面介绍如何提高灵敏度：样品处理过程、进样量、HPLC条件的优化、MS条件的优化。
1、在样品处理方面，主要有三种方法：液液萃取、固相萃取SPE、沉淀蛋白法。也可以用一种反提的方法，适用于极性大的化合物，先用有机溶剂沉淀蛋白后，把上清液用另一种有机溶剂反萃取，再分离出水相，因为极性大的待测物主要在水相。
2、进样量的影响：虽然进样量增大一般会提高灵敏度，但色谱柱的容量有限，由于“柱头效应”的影响，会导致色谱峰变宽甚至形成平头峰，所以一般进样量不宜过大，一般来说，反而是越小越好。
3、HPLC条件的优化
色谱柱的选择：在液质联用中，可以用很短的柱子（比如5cm或2cm），不仅节省流动相用量，还缩短了分析时间。另外，使用短柱也能提高灵敏度，只要和前面峰分开，使用短柱可以减少峰的扩散，一定程度上提高灵敏度。应针对不同的分析物选择相应的色谱柱，这时，可以问色谱柱的供应商要一些应用资料、另外，利用库检索、文献等都能更好地选择色谱柱。
在保证好的分离的情况下，流动相中有机相的比例稍提高一些，可以使峰形变窄，灵敏度更高。流动相中也可以加入一些化合物（如甲酸等）提高信号灵敏度；另外举了一个例子，在做负谱时，用氨水将pH调到10左右，灵敏度会提高。
流动相中不能有不可挥发的盐（如磷酸盐），有些在HPLC中使用的扫尾剂如三乙胺和三氟乙酸都会影响质谱的响应信号，一般质谱只能忍受万分之几（如万分之五）的这类试剂。
有机相比例和流速的影响。质谱属于质量型检测器，而紫外属于浓度型检测器。对反相色谱而言，提高有机相比例色谱峰会提前，UV峰面积不会变化，但MS的峰面积会增加（一般，有机相比例适度提高会增加离子化效率，从而导致峰面积增加）。提高流速，对UV而言，因为浓度变小（样品被稀释），所以会减小峰面积，峰高也不会增加；而对质谱，提高流速会使峰形变窄、峰高增加（灵敏度增加）。为了更好地说明这一点，李老师用对比实验演示了这种效应。
梯度的影响：一般，如果体系不复杂，采用等梯度洗脱，分析速度会快；这是因为：（1）梯度洗脱时，样品之间要有平衡时间；（2）梯度洗脱时，液相色谱的梯度也有梯度延迟（一般会有零点几分钟左右）。如果采用梯度洗脱，不能用太短的柱子，比如要用到10cm以上的。另外，梯度上升时，基线会增高。要把样品峰出峰时间放在梯度上升完之后。做实验时，要考虑梯度延迟的时间。
另外还介绍了柱温的影响，并要注意柱子的疏水崩塌现象。
4、质谱条件的优化：
MS条件的优化主要目的是尽量提高待测物的质谱响应信号。主要参数有ESI喷雾电压、APCI的电流、DP值、碰撞能量，雾化气辅助气的流速，离子源的温度。
虽然各个仪器的参数不大一样，但优化的过程都是类似的：首先用针泵进样，来优化质谱各参数；然后不接柱子，用流动相、LOOP环进样来优化参数。优化好后，再用实际柱上进样来做实际的样品。李老师还演示了ABI质谱优化的一段小视频，大部分电学参数仪器会自动优化。
质谱的分辨率也会影响信号强度。在背景干净时，可以把分辨率降低，会采集到所有的同位素峰，信号强度会增大；但如果背景较“脏”，应提高分辨率，减少背景的干扰。
采集速度也会影响，基本原则是一个色谱峰要采集到足够的点；这在多个样品同时测定，几乎同时出峰（或超快液相）时需要更加注意，既要采集到各个峰，又要在每个样品峰上采集到足够的点。
笔者注：这些经验性的探索，非常实用，但也需注意，各种应用、使用各类仪器的用户参考这些经验的前提是：前面提到的经验多是固定其它条件来考虑的，实际实验中还应考虑更多的影响因素（比如离子化效率、基质效应等）。另外，这些经验对做药代动力学的用户最有用，对于其它LC-MS应用（如蛋白质组学、药物多残留检测）有一定帮助。这里主要针对的质谱是ABI的质谱。
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QTrap 5500和三重四极5500型质谱仪
——更快、更灵敏、多残留测定更方便，且大大增强了阱的性能
AB公司10月全球推出了5500仪器，并于11月在中国召开了新品发布会，大家对这款新仪器的热情非常高，虽然是最后一个报告，但大家听得非常专注。AB公司质谱产品部的技术经理李立军为大家介绍了最新的Qtrap 5500的特点。Qtrap 5500的功能已把三重四极杆的5500功能都包括了，所以李工重点介绍了Qtrap 5500。
AB公司质谱产品部的技术经理李立军：QTrap 5500和三重四极5500型质谱仪
首先介绍了外观和体积，体积小巧是5500相对以前仪器非常重要的改进。
5500集所有附件为一体。面板有切换阀，下面有一个预留的位置，可以供客户再装一个阀。离子源在中间，右边是针泵（向上走），右上边是仪器状态显示灯。 体积比前几代型号减少了44％。
ABI还能提供给5500一个箱子，把机械泵、氮气发生器都做进去，可以减少噪音和总的占地体积。
ABI 5500系统在硬件上的六大技术创新
一、接口的改进：提高了QaQ/MRM灵敏度
使用了QJet离子导向技术（注：在API 5000之前的型号，使用的是Skimmer），
接口的改进
- Orifice直径为0.62 mm，QJet长12.5 cm，孔径4mm，IQ0入口孔径为1.7 mm；
- 四极杆加上高达1.228 MHz的RF频率，提高了能有效聚焦离子的电位，低质荷比的离子传输效率有极大的提高，虽然5500 的m/z范围为5～1000 amu，但灵敏度更高。
- 同时，减小碰撞室、IQ2和IQ3聚焦孔径，相对地提高了分子泵在分析区域的抽力，当进行MS/MS扫描时，也提高了分析器的真空，从而提高灵敏度。
二、创新的QJet™-2离子透镜，极大地提高了系统的灵敏度，改善了真空的分配
QJet-2离子透镜用于聚焦来自离子源的离子，在四极杆上只加RF射频电压；大孔径设计使更多离子能进入质量分析器；用气动学原理和RF射频电压将离子捕获，并聚焦进入质量分析器的高真空区域。这是提高灵敏度的基础。
QJet-2实物图
三、创新的弯曲的LINAC碰撞室，提高了离子传输速度，增加了离子容量，改善了质谱数据质量
核心结构图
Q2是弯曲的LINAC碰撞室，它提高了LINAC轴向电场，所以具有更快的离子传输能力。优势在于：（1）减小仪器体积，减轻分子泵的压力（只需一个分子泵）；（2）弯曲碰撞室设计可极大地降低中性物质的进入；（3）硬件的改进以及新的线性加速器的设计，再结合软件和电子学的完善，在进行MRM实验时，具有更短的停顿时间和驻留时间，同时不降低质谱数据质量（比如时间即使为几个毫秒，灵敏度不下降）。比如通常，Q2的电压为50V，相比以前仪器的1.9V，可以使离子获得更快的加速。
四、提供了线性加速的离子阱Linear Accelerated™ Trap：更快的扫描速度，更快的分析时间
线性加速的离子阱
提高线性离子阱灵敏度的原因来自于：
（1）线性加速离子阱技术，是在线性离子阱内增加一轴向电压，目标离子在扫描前更向萃取区域集中（离子被浓缩）。
（2）改善散射场：在离子萃取区适当增加一定相辅助射频电压
谱图质量更高、离子阱内的质谱碎片更丰富的原因来自于：
（1）脉冲气的引入能更快地冷却离子
（2）脉冲气和更高的RF电压，能在很短的离子激活时间内在离子阱内产生更丰富的离子碎片信息
以前的Qtrap3200和Qtrap 4000，离子阱的扫描速度为4,000 amu/sec，Qtrap 5500提高到20,000 amu/sec。
更短的离子阱碎片扫描时间，以前是几个毫秒，现在可到50微秒
优点：
- 更高离子容量的线性离子阱
- 灵敏度提高（阱的扫描灵敏度提高了100倍）
- 扫描速度提高5倍（20,000 amu/sec）
- 离子填充时间缩短20倍
- 分辨率提高2倍（优于12,000）
- 质荷比精度提高3倍
五、创新的AcQuRate™脉冲离子计数检测器：确保系统的重现性和精确性
脉冲离子计数器是在某一时间内检测离子碰撞到电子倍增器时产生的离子脉冲，输出一与离子流相关的数字信号。它与模拟检测器相比，更不容易受背景噪声的影响；而且不需过滤信号。
在不同浓度点的重复性非常好。比如在1～100 fg/uL的极低浓度下，如果用模拟检测器，精密度很差，CV甚至达到40％，而用了脉冲离子计数器，CV总在3％以下。所以，脉冲离子计数器不仅非常灵敏度，同时还具有极高的精密度。
六、创新的eQ™ Electroics电子系统：确保快速扫描，ESI的快速正负切换
eQ电子系统的设计，使串联四极杆的速度提高了四倍而不降低灵敏度；碰撞室采用动态轴向设计；母离子扫描和中性丢失扫描的性能没有降低。
极大的优点是提供更快的MRM速度：
我们知道，MRM的速度跟几个因素有关，扫描速度、离子驻留时间（dwell time）、MRM切换速度，有时需考虑正/负离子切换速度。
MRM实验中扫描的是一个质量数，所以扫描速度（2,000 amu/sec）已经远远超过了MRM实验的要求；过去制约速度的瓶颈是离子驻留时间，过去常需要几十毫秒，如果过短，数据质量会受到影响。对于MRM切换速度存在同样的瓶颈。
5500的创新设计使其即使在2毫秒的驻留时间、2～3毫秒的MRM切换速度下，不降低数据质量，因此真正解决了当前MRM速度的瓶颈。同时，具有更快的ESI正负极性切换速度（50毫秒）。
整体性能上，在MRM方面，一次实验可检测2500对MRM离子，一个时间段内可检测1000对MRM离子，同时不降低数据质量。
多残留检测的领先者：2003年100对MRM，2005年300对MRM，2008年>750对sMRM
综合起来，得到一个无与伦比的高灵敏度和高速度。具体的指标没有给出，但显示了几张图：MRM实验，5 fg利血平，信噪比S/N 为57:1；on column柱上进样，10 fg利血平，信噪比S/N为23:1。
s-MRM（scheduled MRM），提高了定量分析的效率
最后，还介绍了多残留检测，一个帮助用户快速设定方法的、极为有用的功能S-MRM（scheduled MRM，编程的MRM），它是Analyst 1.5的新功能，不仅用在5500上，还可以帮以前的用户做升级。
它的特点为：
- 每对MRM离子的检测只在相应的色谱保留时间内进行
- 每对MRM都有最恰当的循环时间和驻留时间
- 使定量分析的重现性和数据的可靠性有保证
这种智能逻辑优化将大大提高多残留测定方法的开发速度，把标准品做一遍后，可以由软件s-MRM自动优化，具体做法是：在第一次实验中，用户提供MRM相关信息（比如各个子、母离子对的质量），目标色谱峰的大致保留时间（不要求特别精确），希望驻留多少时间等信息。然后仪器就会自动优化，存储为方法，下一次实验就可以很方便地调用该方法了。这项功能将大大减轻多残留测定用户的负担，使开发变得更容易。
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