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枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验——化学改进法

2019.3.27

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可应用于：（1）建立枯草芽孢杆菌转化体系；（2）其基因改造；（3）提高枯草芽孢杆菌生产性能的相关研究。

实验方法原理	用GM I和GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a，用改进的方法制备感受态细胞。
实验材料	野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a
试剂、试剂盒	Spizizen salts母液 CaCl2 氨基酸 GM II培养基 GM I培养基MgCl2 酵母粉 K2HPO4·3H2O 水解酪蛋白葡萄糖柠檬酸钠蒸馏水 KH2PO4 MgSO4
仪器、耗材	微孔滤膜离心机锥形瓶离心管灭菌锅摇床
实验步骤	一、实验材料准备 1. 枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液（1）10xSpizizen salts母液： 15% K₂HPO_4·3H₂O，6% KH₂PO₄，2% (NH₄ ) ₂SO₄，0.2% MgSO₄，1% 柠檬酸钠，溶于蒸馏水中，6.6 x10⁴ Pa高压灭菌，室温贮存。（2）10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl₂， 6.6 x10⁴ Pa高压灭菌，酵母粉溶液最好现用现配，水解酪蛋白和 MgCl₂溶液可室温贮存；20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl₂，用0.22 um的微孔滤膜过滤除菌，葡萄糖溶液和CaCl₂ 溶液室温贮存，氨基酸溶液- 20℃ 贮存。 2. 枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基（1）GM I：1mL 10 xSpizizen salts， 0.1 mL，10% 酵母粉，0.25 mL 20% 葡萄糖，0.2 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL。（2）GM II：1 mL 10xSpizizen salts，0.05 mL10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖，0.04 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸， 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl₂， 1 mL 25 mmo l/L MgCl₂，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。二、实验步骤 1. 挑取一新鲜培养的野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a菌落接种于2.5 mL GMI培养基中，30℃，130-150 r/min振荡培养过夜。 2. 将过夜培养物按10%接种量接种于2.5 mL新鲜的GM I中，37℃，200- 230 r/min振荡培养3.5h。 3. 再将培养物进行第二次传代，接种于5 mL GMII培养基中，野生型菌株BS501a按5% 接种量进行第二次传代，37℃，200-230 r/min振荡培养90 min。 4. 取1mL培养物，5 000 r/min室温离心5 min，用1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。