等电点聚焦分离蛋白质实验
实验方法原理 等电点聚集（IEF） 分离可以通过 CE 轻易地达到，这也是选择随后用于蛋白质分离的缓冲液系统的有效的第一步。蛋白质和多肽是两性的，因此它们的电荷由周围的载体缓冲液决定。当蛋白质或多肽处于电场中，它移动到一个区域，这里周围的 pH 等于其等电点（pI）。在包被的毛细管柱内可以通过在柱内充满含两性电解质的样品溶液而达到 PH 梯度。高 pH 溶液（氢氧化钠）放置在阴极池内，低 pH 溶液（磷酸）放置在阳极池内。电场通贯整个柱，两性电解质和样品移至柱上相应于它们各自的 pI 的位置上。如果分子漂移出等电点区域，就会被周围的 pH 溶液诱导出电荷，然后分子就会移回至 0 电荷位置。以 0.01 pH 单位的次序用 pI 解离形成窄区域。为决定柱内某一特定蛋白质的 pI，在样品混合物中加入已知 pI 的标记物，在标记物之间推断出感兴趣蛋白质的 pI。在 EOF 的缺失下，分离样品后，需要蛋白质迁移通过探测器。用阴极池内的缓冲液替代阳极池的就可以产生 EOF，可以使得样品区迁移通过探测器。这里讨论的分离是假设聚焦过程中柱内没有 EOF。但也可以在 EOF 存在的情况下进行分离。
实验材料 含 0.5～1.0 mg 蛋白质／ml 的溶于水的样品
试剂、试剂盒 两性电解混合物(pH 3~10)20 mmol／L 氢氧化钠(存储于 4℃)10 mmol／L 磷酸(存储于 4℃)
仪器、耗材 50 μm内径包被的硅毛细管柱CE 仪器
实验步骤
1. 将两性电解质混合物加入 0.5 ml 蛋白质样品中以达到两性电解质终浓度 2.5％（V/V）。如果需要，加入 IEF 标记达到终浓度 0.1 mg/ml 以校准柱子。
2. 加入样品池。以增压池子（0.5 lb/in2） 的方式注满毛细管。
3. 在阳极池（负极）内放置 10 mmol/L 磷酸，在阴极池（正极）放置 20 mmol/L NaOH。
4. 在 8～10 kV 恒定电压下聚焦样品 4～6 min。检测电流直至其达到稳定状态。
5. 通过放置 20 mmol/L NaOH 在阳极的方式迁移样品，调电压至 10 kV。检测蛋白质通过探测器迁移 15～20 min。
6. 每次运行后以 0.5 lb/in2 用 10 mmol/L 磷酸洗涤柱子达 1 min。室温下将柱子存储于运行缓冲液（短期）或水（长期）中。
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