用受体内化分析技术来探索与CXCR2结合的激动剂
实验概要
之前我们观察到细胞因子MIF和CXCL8二聚体的单体结构具有表面结构同源性，因此我们检测了MIF是否可以直接与CXCL8的同源受体CXCR2相互作用。受体内化是配体或激动剂与受体之间功能互动的可靠检测手段，它往往发生在配体结合之后。在稳定过表达CXCR2的人类上皮肾细胞（HEK）或RAW 264.7巨噬细胞中进行受体内化分析及其他生化反应检测，我们发现MIF实际上能与CXCR2相互作用，并能产生与其同源配体CXCL8所介导相差不大的CXCR2内化率。
主要试剂
重组CXCL8(PeproTech EC/CellConcept，Umkirch，德国)
抗人CXCR2的抗体(MAB331，R&D systems)
稳定表达CXCR2的HEK293细胞(Ben-Baruch实验室，以色列)
稳定表达CXCR2的RAW 264.7细胞(Bernhagen实验室，德国)
主要设备
流式细胞仪(FACSCalibur流式细胞仪，BD公司，海德堡)
实验步骤
1. 12孔板中，在10%的FCS/DMEM培养液中过夜培HEK293-CXCR2(105细胞/孔)细胞；
2. 将培养液换为0.5%的FCS/DMEM；
3. 用激动剂处理细胞，如CXCL8(0-100 nM)或rMIF(0-1μM)，37℃处理45分钟；
4. 去除培养液，将细胞用预冷的酸性甘氨酸缓冲液(50 mM的甘氨酸，150 mM氯化钠，pH值2.7)冲洗一次，用预冷的PBS冲洗两次；
5. 细胞用鼠抗人CXCR2抗体(MAB331，R&D systems)或同型对照(IgG 2a)染色(两种免疫球蛋白用含1%FCS的PBS按1:500稀释)，在4℃处理45分钟；
6. 用预冷的PBS冲洗三次；
7. 细胞与FITC标记的抗鼠二抗4℃共孵育30分钟；
8. 流式细胞仪分析荧光信号；
9. 用相对荧光强度来计算受体的内化率，公式如下：
{(MFI[实验组]-MFI[0%对照组])/(MFI[100%对照组]-MFI[0%对照组])}×100
MFI：几何平均荧光强度
100%对照组：为20 mM磷酸钠缓冲液单独处理细胞后CXCR2在细胞表面的表达
0%对照组：指与IgG 2a抗体共培养的细胞
