Western Blot Protocol
一、提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl 100%酒精充分混匀，静置5min(RT), 2000×g , 4℃离心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl异丙醇, 混匀, 静置10min(RT), 12000×g, 4℃离心10min, 弃上清, 加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀, 用加样器打散沉淀, 混旋20~30秒, 静置20min(RT) , 7500×g, 4℃离心5min, 弃上清 , 重新加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次, 重悬沉淀, 离心后弃上清, 加入100% 无水乙醇 1ml, 混旋1min, 静置20min(RT), 7500×g, 4℃离心5min, 弃上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g, 离心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各样品10 ul，加DW 990 ul
2. 取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5 ml。
3. 向各管加入2.5 ml D试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5ml A－2%[陈星云1][陈星云1]Na2CO3、0.1N NaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4. 迅速加入酚试剂0.25ml，混匀 37℃ 水浴30分钟。
5. 721分光光度计650 nm，比色，S0标准管调零。
6. 最后稀释为4 ug /ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug / ul，上样量为30～80ug / 泳道。
三、电泳
1. make gel．
11%分离胶 12ml 两块胶 | 4%积层胶6ml两块胶 |
DW 4.36 ml | DW 堵漏 3.66ml |
3M Tris 3.0 ml | 0.5M Tris 1.5 ml |
30%Arc 4.4 ml | 30%Arc 0.5 ml 0.78 ml |
10%SDS 0.24 ml | 10%SDS 60 ul |
10%APS 0.12 ml | 10%APS 20ul 30 ul |
TEMED 10ul | TEMED 5ul 6ul |
2. 上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30 S。
3. 通电电： 积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4. 考马斯亮蓝染色： 1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1. 将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2. 转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1. 取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2. NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6% non－fat milk的pH7.2的PBS中封闭，室温 ６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3. 将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4. 加入一抗 1:1000－1200，室温，反应1小时
5. PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6. 加入二抗 1:5000，室温，反应1小时。
7. PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1. 混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2. 放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3. 显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液 4×1L：
NaH2PO4（·H2O） | 12.48g |
Na2PO4·12H2O | 114.6g |
NaCl | 3.6g |
dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L | |
（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
500ug / ml BSA | NS | 蛋白浓度ug / ml | |
S1 | 50 ul | 1.95 ml | 12.5 |
S2 | 100 ul | 1.90 ml | 25 |
S3 | 200 ul | 1.80 ml | 50 |
S4 | 400 ul | 1.60 ml | 100 |
S5 | 800 ul | 1.20 ml | 200 |
3. 30%Acrylamide
29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60 mlDDW，调Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
称Tris 36.3g溶于水到100 ml，调pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
称Tris5.98g溶解后，调pH到6.7，调体积到100ml
6. Samples buffer 10ml
10%SDS | 2 ml | |
甘油 | 1 ml | |
0.5M Tris | 1.6 ml | 用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚兰、0.5% DTT贮备液。 |
DDW | 5.2 ml |
7. 电转液 1L pH 8.2－8.3
Glycine | 14.42 g |
Tris base | 3.02 g |
dH2O | 800 ml |
Methanol | 200 ml |
10% SDS | 2 ml |
8. pH 7.2 PBS 2 L
