血管紧张素转换酶2(ACE2)活性荧光检测方法
1.样品的准备。
a.血液样品的准备。
对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备。
对于培养的贴壁细胞，PBS 洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g,
5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl Lysis Buffer的比例加入Lysis
Buffer，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4℃约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl
Lysis
Buffer的比例进行匀浆。4℃约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
2.试剂盒的准备。
将Assay Buffer、Substrate和MCA Standard等试剂平衡至室温后分别混匀备用。Positive Control (10X)存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
3.阳性对照的准备。
取适量的Positive
Control (10X)并加入Assay Buffer对Positive Control (10X)进行10倍稀释。例如，取5μl
Positive Control (10X)，加入45μl Assay Buffer，混匀，即得50μl Positive Control
(1X)。96孔板检测时，通常每孔10μl Positive Control (1X)即可。
4.MCA标准曲线的设置。
取2μl
MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混匀，即为200μl
100μM的MCA溶液，分别取0、2.5、5、10、20、30、40、50μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay
Buffer补足至100μl，此时，MCA标准曲线的各孔MCA浓度和物质的量分别为0、2.5、5、10、20、30、40、50μM或0、0.25、0.5、1、2、3、4、5nmol。也可自行设置适宜的MCA浓度进行标准曲线的设定。
5.检测体系的设置：
参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可以稀释一系列浓度梯度，以确保最终检测值在标准曲线线性范围内。待测样品的稀释倍数记为dil。
| 待测样品 | 空白对照 | 阳性对照 | 待测样品 |
| Assay Buffer | 88μl | 88μl | 88μl |
| Positive Control (1X) | - | 10μl | - |
| Lysis Buffer | 10μl | - | - |
| 待测样品 | - | - | 10μl |
| 总体积 | 98μl | 98μl | 98μl |
注：为获得更加可靠的检测结果，推荐每个样品设置3个复孔。
6.检测。
a.振荡混匀1-2分钟，确保混合充分。
b.除MCA标准曲线外每孔加入2μl Substrate，混匀。注：加入Substrate后反应会立即开始，如果孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入Substrate的时间差而导致的误差，混匀操作可在培养板振荡器上进行。
c.混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为325nm、发射波长为393nm，每5分钟或10分钟读取一次数值。
注1：连续测定的时间可以根据待测样品中ACE2的酶活性进行调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于ACE2的酶活较高的样品，建议测定总时间为20分钟或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟；对于ACE2的酶活很低的样品，可以延长测定总时间为1至2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。
注2：如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。
7.计算。
a.计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU阳性对照和RFU待测样品。RFU，Relative
Fluorescence
Unit。选取待测样品组MCA荧光强度呈线性关系的时间点的数据用于分析，记录呈线性关系的时间间隔为T，时间间隔T内的荧光强度变化量为ΔRFU，即ΔRFU=
RFU待测样品(Time b) - RFU待测样品(Time a)。
b.也可以直接比较各个样品在一定时间内的ΔRFU而确定样品的ACE2相对活性，但须确保最终时间点时RFU读数未达平台。
c.也可将标准曲线各孔的荧光值减去标准品零浓度孔的荧光值，建立MCA标准曲线。将ΔRFU代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中MCA的生成量(记录为A)。MCA的标准曲线请参考图2A，MCA在0.02-5nmol
(即0.2-50μM)范围内有良好的线性关系。ACE2蛋白酶活性的计算公式如下：
ACE2 Activity (nmol/min/mg或U/mg) = A× dil/ (Vsample × T × C)
注：Vsample为检测时待测样品的体积(Vsample=10μl =0.01ml)；
A为步骤7c根据标准曲线确定的MCA的生成量(nmol)；
dil为步骤5中样品稀释倍数；
C为样品蛋白浓度(mg/ml，检测步骤参考碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒或去垢剂兼容型的Bradford蛋白浓度测定试剂盒)；
T为步骤7a中反应时间(min)。
酶活力单位的定义为：温度37℃条件下，每分钟催化生成1nmol MCA酶量定义为一个单位(Unit, U)。
d.虽然本试剂盒中的ACE2底物已经比较特异，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用ACE2特异性抑制剂MLN-4760 进行验证。
图2.
碧云天血管紧张素转换酶2(ACE2)活性荧光检测试剂盒的MCA标准曲线和对ACE2阳性对照及组织样品的检测效果图。A.
本试剂盒的MCA标准曲线示意图。B. 不同量的ACE2 Positive Control (1X)酶切底物，生成产物的荧光强度示意图。C.
小鼠不同组织的ACE2酶活性检测效果及MLN-4760的抑制效果。总蛋白量都为10μg，抑制剂为MLN-4760 ，终浓度为500nM)。D.
ACE2 Positive Control (1X，10μl)及抑制剂MLN-4760
(终浓度为500nM)在293T细胞裂解液中的检测效果(总蛋白量为22μg)。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
