冠状病毒防御战之巨噬细胞（二）
▲▼ 体外巨噬细胞极化方案 ▼▲ 人的巨噬细胞包括经典活化型巨噬细胞(Classical activated macrophages, M1)、替代活化型巨噬细胞(Alternatively activated macrophages, M2)以及未刺激活化的巨噬细胞(M0)。人巨噬细胞的体外分化由单核细胞而来，M0 型巨噬细胞用含自体血清(10%)的完全培养基培养单核细胞6 天，隔天半量换液即可；M1 型巨噬细胞分化用 20ng/ml 的 GM-CSF 分化单核细胞 6 天，或者用 20ng/ml的 M-CSF 分化 6 天，并加 20ng/ml 的 IFN-γ 和LPS极化 1 天；M2 型巨噬细胞用 20ng/ml的 M-CSF 分化 6 天，并加20ng/ml的 IL-4/IL-10极化 1 天。在显微镜下观察完成分化的细胞形态发现 M1细胞贴壁最牢，呈梭形；M2 细胞贴壁能力较M1弱，呈圆形或椭圆形；M0 细胞贴壁中等，呈圆形(图2)。
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| 图2：人巨噬细胞极化步骤 |
| 而体外小鼠的巨噬细胞的研究由骨髓细胞分化而来，骨髓细胞加入 20ng/ml
M-CSF，隔天半量换液，诱导分化 6 天后即为 BMDM0，加 20ng/ml
IFN-γ和LPS极化一天分化为BMDM1；加20ng/ml的IL-4/IL-10极化一天，即分化为 BMDM2(图3)。 |
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| 图3：小鼠巨噬细胞极化步骤 |
| ▲▼ 巨噬细胞的鉴定 ▼▲ |
| 对分化后的人单核细胞来源的巨噬细胞进行表型鉴定发现M1型巨噬细胞CD14 高表达，清道夫受体(Scavenger
receptors, SR,CD163)低表达，甘露糖受体(Mannose receptors, MR, CD206)不表达；在 M2
细胞中，CD14 高表达，CD163 和 CD206均高表达; 在 M0 细胞中，CD14 高表达，CD163 低表达，CD206
中表达。同时对三种巨噬细胞进行分泌细胞因子的鉴定，M0、M1 细胞经LPS活化后，以释放大量促炎性细胞因子 TNF-α 为主，几乎不释放
IL-10；而M2 细胞经LPS活化后，则以释放大量抑炎性细胞因子 IL-10 为主，只释放少量的 TNF-α[10]。 对小鼠骨髓细胞来源的不同亚型巨噬细胞分泌的细胞因子分析发现：M1型巨噬细胞IL-12 水平显著上升, 其IL-10 的分泌略有增加，同时高表达iNOS；而M2型巨噬细胞其IL-10分泌水平明显增加, 而IL-12 水平很低，Arginase-Ⅰ的表达和活性显著增加。其表面标志性分子表达分析：M2 与M1 型巨噬细胞相比，CD163、CD206 和Dectin-1 表达明显上调[4]。 |
| ▲▼ 巨噬细胞功能 ▼▲ |
| M1型巨噬细胞由IFN-γ及LPS等极化产生，释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23等促炎性细胞因子，抗原提呈能力和吞菌能力增强，作为抗原提呈细胞(antigen
presenting cells, APCs)，能够促进适应性免疫应答的发生。M2型巨噬细胞由IL-4 或IL-13 诱导，CD206
和精氨酸酶表达增高，内吞能力增强，分泌IL-10、TGF-β等抑炎性细胞因子、促进Th2细胞分化，发挥免疫调节及组织修复功能，其抗原提呈能力较弱，在寄生虫免疫反应、变态反应、伤口愈合和组织重构中发挥重要作用[5,
11]。M2 型巨噬细胞的不同亚型分别发挥不同功能(图4)。M2a 由IL-4
或IL-13诱导产生，高表达CD206，内吞活性增强，促进细胞生长和组织修复，介导 Th2 型免疫反应。M2b 由免疫复合物和LPS /IL-1
刺激诱导产生，可以同时产生抗炎和促炎细胞因子IL-10、IL-1β、IL-6，执行免疫调节功能，并能促进Th2活化并增强体液免疫。M2c
型巨噬细胞，又称失活型巨噬细胞，由糖皮质激素、IL-10 或TGF-β 诱导产生，低表达MHCII
分子，在基质沉淀和组织重塑中发挥作用，此外，M2c型巨噬细胞可通过释放大量的IL-10和TGF-β抑制免疫反应，对凋亡细胞表现出强烈的抗炎作用[5,
12]。 |
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| 图4：不同巨噬细胞亚型功能 |
| ▲▼ 病毒感染调控巨噬细胞极化过程 ▼▲ |
| 在病毒感染急性期，巨噬细胞向M1方向极化，M1型巨噬细胞可促进炎症反应，辅助机体清除病原体，但其过度活化可引起细胞因子风暴，加重组织的免疫病理损伤，且M1 型巨噬细胞极化比例与病情严重程度呈正相关; 随着病毒感染相关疾病的进展，巨噬细胞向M2方向极化，M2型巨噬细胞可通过分泌多种抑炎因子发挥免疫调控作用，参与组织修复[13, 14]。巨噬细胞极化不是M1 /M2 两个极端，而是一个连续的巨噬细胞活化谱。Herbein等基于逆转录病毒感染提出了M1 /M2 重塑模型，即在感染早期M1型巨噬细胞极化占优势，M1型巨噬细胞是机体细胞因子风暴和免疫病理损伤产生的重要因素。在感染慢性期M2型巨噬细胞极化占优势，促进组织修复并重建免疫稳态抑制M1型巨噬细胞方向极化，有利于控制炎症反应，改善急性病毒感染患者的疾病预后[15]。 |
| 巨噬细胞是一种异质性与可塑性较强的细胞，在病毒感染诱导炎症反应的进展和消退中巨噬细胞极化发挥重要的双重调控作用，是极具潜力的治疗急性病毒感染所致疾病的细胞。阐明巨噬细胞极化在病毒感染过程中的作用及相关调控机制，可为病毒感染性疾病的发病机制研究及治疗策略提供新的思路。 |
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| 参考文献 |
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1.McBride, R., M. van Zyl, and B.C. Fielding, The coronavirus
nucleocapsid is a multifunctional protein. Viruses, 2014. 6(8): p.
2991-3018. |
