新型冠状病毒荧光PCR引物探针设计之我见（二）
1、引物探针的位置
引物探针的设计原则中，最重要的是要避免假阴性（漏检），同时保证特异性（避免假阳性），所以要选择组内（需要检出的序列）保守（即尽量避开突变或采用简并序列）、组间（对照序列）特异的区域。此外，为了获得最佳的扩增效果，还应尽量满足表1中的基本要求。
用SARS和蝙蝠CoV的N基因序列作为对照，对新型冠状病毒的N基因序列排序，从图1、2、3中可见，在美国CDC的设计中，除了第二套的上游引物不特异外，其余探针和引物的位置都是选择了组内保守组间特异的区域。第二套的探针和下游引物都是在特异的区域，所以也不会产生非特异的扩增。
图1：美国CDC 2019-nCoV 第一套引物探针位置
图2：美国CDC 2019-nCoV 第二套引物探针位置
图3：美国CDC 2019-nCoV 第三套引物探针位置
第三套设计的探针N3P对2019-nCoV不特异（可同时结合到蝙蝠CoV）,5’端第二个位置设置为Y即T/C简并，恰恰不能区分新型冠状病毒、蝙蝠冠状病毒和SARS病毒。但是上下游引物均为2019-nCoV特异，可能不会产生非特异性（假阳性）扩增。
2、Tm值
Taqman探针法荧光PCR通常采用二步法，即在94℃左右变性，60℃退火和延伸。所以，通常引物的Tm值设计在60±2℃，探针在70±2℃。
图4: 美国第一套设计的Tm值
图5：USCDC N基因第二套Tm值
图6a: USCDC N基因第三套Tm值，探针5’端第二个序列为C
图6b: USCDC N基因第三套Tm值，探针5’端第二个序列为T
从图4、5、6中可见，这三套设计中的Tm值基本符合表1中的要求。第三套的探针N3P 5’端第二个序列设计为Y（T/C简并），此处为C时（图6a），探针N3P的Tm值略高，但通过优化应该不会成为主要问题。
3、引物和探针的发夹结构
稳定的二级结构（二聚体或发夹）降低引物探针利用效率的重要因素，特别是探针的发夹，容易造成探针利用率降低，从而使荧光信号偏低，影响检测灵敏度。通常应控制发夹的dG≥-1.0 (注：dG是一个用于衡量裂解二聚体或发夹所需要能量的参数，二级结构越稳定，裂解所需的能量越多，dG越小)。
采用DNA Star软件对美国CDC设计的三套引物探针的发夹结构进行分析，结果（图7）发现，第一套的下游引物N1R具有一个稳定的发夹结构（dG=-2.3kc/m），第三套的探针N3P具有一个稍微稳定的发夹结构（dG=-1.3kc/m），其余引物和探针均没有稳定的发夹。
图7：USCDC引物和探针的发夹结构
