实验室分析仪器--液相色谱仪分离过程中流动相的选择
流动相
1、流动相的性质要求
理想的液相色谱流动相溶剂应具有黏度低、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少,相应的容量因子k降低;而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加,相应的容量因子 k 升高。因此,k 值是流动相组成的函数。塔板数 N一般与流动相的黏度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面。
(1)在选择流动相时,一般采用色谱纯试剂,必要时需进一步纯化,以除去有干扰的杂质。因为在色谱柱整个使用期间,流过色谱柱的溶剂是大量的,如溶剂不纯,则长期积累杂质而导致检测器噪声增加。
(2)流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
(3)流动相必须与检测器匹配。使用 UV 检测器时,所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小。当使用示差折光检测器时,应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相,以提高灵敏度。
(4)流动相的黏度要低(应<2cP,1cP=10-3Pa·s)。高黏度溶剂会影响溶质的扩散、传质,降低柱效,还会使柱压降增加,使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
(5)流动相对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不但影响纯化分离,且会使柱子恶化。
2、流动相的选择
正相色谱的流动相通常采用低极性溶剂如正己烷、苯、氯仿等加适量极性调整剂,如醚、酯、酮、醇和酸等。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂,再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂,如甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占的比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下,甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求,且流动相的黏度小、价格低,是反相色谱最常用的流动相。但与甲醇相比,乙腈的溶剂强度较高且黏度较小,并可满足在紫外185～205nm 处检测的要求,因此,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
在分离含极性差别较大的多组分样品时,为了使各组分均有合适的k值并分离良好,需采用梯度洗脱技术。
例如:乙腈的毒性是甲醇的5倍,是乙醇的25倍。价格是甲醇的6～7倍。
反相色谱中,如果要在相同的时间内分离同一组样品,甲醇-水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈-水或四氢呋喃-水的冲洗强度配比有如下关系:
式中,C 为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈-水或66%的四氢呋喃-水的冲洗强度。
3、流动相的 pH 值
采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的 pH 值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸,流动相的 pH 值越小,组分的 k 值越大,当 pH 值远远小于弱酸的 pKa 值时,弱酸主要以分子形式存在;对于弱碱,情况相反。因此,分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和1%乙酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和30mmol/L 三乙胺溶液(流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象)。
4、流动相的脱气
HPLC 所用流动相必须预先脱气,否则容易在系统内逸出气泡,影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率,影响检测器的灵敏度、基线稳定性,甚至使无法检测(噪声增大,基线不稳,突然跳动)。此外,溶解气体还会引起溶剂 pH 的变化,给分离或分析结果带来误差。离线(系统外)脱气法不能维持溶剂的脱气状态,在停止脱气后,气体立即开始回到溶剂中。在1～4h 内,溶剂又将被环境气体所饱和。在线(系统内)脱气法无此缺点。最常用的在线脱气方法为鼓泡,即在色谱操作前和进行时,将惰性气体喷入溶剂中。严格来说,此方法不能将溶剂脱气,它只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
溶解氧能与某些溶剂(如甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物,此络合物会提高背景吸收(特别是在260nm 以下),并导致检测灵敏度的轻微降低,但更重要的是,会在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰)。在荧光检测中,溶解氧在一定条件下还会引起猝灭现象,特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下,荧光响应可降低达95%。在电化学检测中(特别是还原电化学法),氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高 UV 检测器的性能,也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂,若采用抽气或煮沸法,则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好,10～20min 的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂-水混合液的脱气是足够的(一般500mL溶液需超声20～30min方可),此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触,以免玻璃瓶破裂,容器内液面不要高出水面太多。
5、流动相的滤过
所有溶剂使用前都必须经0.45μm 或0.22μm 滤膜滤过,以除去杂质微粒,色谱纯试剂也不例外(除非标签上标明“已滤过”)。
用滤膜过滤时,特别要注意分清有机相(脂溶性)滤膜和水相(水溶性)滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂,过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液,严禁用于有机溶剂,否则滤膜会被溶解。溶有滤膜的溶剂不得用于 HPLC。对于混合流动相,可在混合前分别滤过,如需混合后滤过,首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
6、流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂,导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于 HPLC 系统,可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变化,也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
纯水、磷酸盐、乙酸盐缓冲液等很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要贮存。如确需贮存,可在冰箱内冷藏,并在3天内使用,用前应重新滤过。容器应定期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子无此现象。
7、使用卤代有机溶剂应特别注意的问题
卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质,能与 HPLC 系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解,不能存放太久。卤代溶剂(如 CCl4、CHCl3 等)与各种醚类(如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等)混合后,可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物,这种混合流动相应尽量不采用,或新鲜配制。此外,卤代溶剂(如CH2Cl2)与一些反应性有机溶剂(如乙腈)混合静置时,还会产生结晶。如果是和干燥的饱和烷烃混合,则不会产生类似的问题。
