耐药质粒DNA的转化
实验概要
本实验介绍了将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆，即转化子。
实验原理
受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca 处理，可改变细胞膜的通透性，利于受体菌对DNA的摄取，这种经Ca 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）基因，如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内，则可使该细菌获得Apr和Tcr，表现出对Ap和Tc的抗药性。
主要试剂
1．LB 液体培养基
2．75mM CaCl2
3．氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）
主要设备
1．灭菌小试管
2. 刻度吸管
3. 微量加样器
4. 离心机
5. L形玻璃棒
实验材料
1．菌株 E.coli RRI
2．pBR322 质粒DNA,
3．感受态菌75mmol CaCl2
实验步骤
1. 感受态菌的制备
1) 将细菌接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养16~20h。
2) 取新鲜菌液，按1/100的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养2~3h。
3) 取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,离心5min，弃上清。
4) 菌体沉淀加入750μl预冷的（4℃）75mmol/L CaCl2 溶液，轻轻吹打菌悬液，放冰浴30min。
5) 4℃3000rpm/min,离心5min，弃上清。
6) 菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCl2溶液，冰浴4min以上。4℃保存备用。
2. 质粒转化
1) 取2个洁净，灭菌的EP管，加入各成分。
2) 上述2个试管充分混均匀后，置冰浴30min。
3) 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
4) 加入1ml LB肉汤培养基，37℃静止培养1h。
3. 转化子筛选
1) 取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）上，对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上，每块板涂0.1ml，用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置37℃培养过夜，观察转化结果。
2) E.coli 受体菌不含有质粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落，可初步确定受体菌获得了耐药性质粒，然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。
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