DNA测序技术的现状和发展（七）
3. 新一代测序技术的前景
在2007年6月，James Watson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是第一次使用非Sanger测序法获得了人类个体基因组序列，并且第一次将个人基因组序列公之于众。整个测序过程在两个月之内就完成了，花费不到100万美元，这只占耗时10年之久的人类基因组计划使用经费的千分之一，同时还是2007年5月 在网上公布结果的Venter基因组计划费用的百分之一。我们比较了454测序仪最初的技术参数（每次可以获得两千万碱基序列，测序长度100bp，准确 率96%）和用于对James Watson进行测序时的技术参数（每次可以获得一亿碱基序列，测序长度250bp，准确率超过99%），结果发现摩尔定律真的适用于基因组测序领域。
454测序仪和其它的新一代测序仪（图7）一起，展示出了小型化技术和并行处理技术的威力，它们提高了处理通量，降低了测序费用。除了引领新一代测 序技术的发展之外，454公司的研发团队还开发了体外DNA文库构建、模板扩增等技术，而且这些技术现在都已经被市场上其它新一代测序仪所广泛使用。很快，随着计算机技术的飞速发展，个体基因组测序的费用将会由100,000美元降低到10,000美元，继而降低到1,000美元甚至更低。个人基因组时代马上就要到来了!
从费用角度、适用范围和限制性来说，传统测序仪和新一代测序仪之间具有明显的差距。因此，对于每一个具体的项目来说，都需要仔细考虑，选择出最合适 的测序仪。传统的Sanger测序法适用于对kb~mb长度的DNA片段进行的小规模的测序项目。Sanger测序法相比新一代测序法而言具有极大的“间隔尺寸（granularity）”，既能用于大型项目也能用于小型项目。虽然与传统测序仪相比，新一代测序仪在某些方面很明显地处于劣势，比如在测序长 度和准确率方面，但即便如此，在处理大规模的测序项目时大家还是倾向于选择新一代测序仪。
看看新一代测序仪对以往使用传统测序仪进行的生殖细胞突变和体细胞突变研究的帮助就可以认识到它们的作用有多么强大。在这项研究里，使用 Sanger测序法除了试剂这一项费用之外，其它的费用也远远高过了使用其它新一代测序仪。这些其它费用包括在96孔板或384孔板中处理样品的费用、电泳费用、大量的生物信息学处理费用以及设备维护人工费用等。研究人员最近对100份样品中的100个基因使用传统测序方法究竟需要花费多少费用进行了一次非正式的调查，假设每个基因平均由10个外显子组成，结果发现整体费用在30万美元至100万美元不等，价格依据测序单位是非盈利的基因组测序中心还是商 业化的测序服务机构而不同。很显然，这么高昂的费用对于任何一个实验室来说都是难以承受的。新一代测序仪除了能将测序费用降低好几个数量级之外，它们还具 有所需仪器设备少的优点，不过新一代测序仪在后续数据处理方面会碰到问题。
各款新一代测序仪之间也有非常明显的差异（表10），它们都有各自“拿手”的绝活（表11）。有一些测序项目，比如重测序 （resequencing）对于测序仪的测序长度要求就没有从头测序的要求高。对于需要依靠标签计数（tag counting）的测序项目，例如在定量分析蛋白质与DNA之间的相互作用时，我们就会更加需要能将待测片段分割成尽量多、尽量小片段的测序方法。测序 的准确度和各自相对拿手的项目，比如是善于发现插入、缺失突变还是善于发现碱基替换突变也是需要着重考虑的问题。另外，在进行从头测序或发现结构性变异的 研究时使用的配对测序法已经广泛应用于各种新一代测序仪当中。这时，这些配对的模板片段在芯片上的分布情况，比如相互之间的距离远近等就是需要重点考虑的问题了。
注：DNA测序领域的快速发展使得对各类测序方法的价格及读长的评估在很短时间内便失去意义。Roche
Applied Science、Illumina及Applied
Biosystems公司目前都在不断推出新的产品。表中列出的测序费用只是对使用的反应试剂费用的一个估算。测序长度指的是单链长度。
最后，需要考虑的当然是价格因素，各个新一代测序仪的费用都不相同，作为消费者，当然希望各个测序仪生产厂家之间的竞争更加激烈一点。单纯比较每个碱基的测序费用是一个不错的选择方法，不过有时这也会误导我们，比如准确率更高的方法当然费用会高一些。
5. 总结
过去几年间，新一代测序技术获得了突飞猛进的进展，同时有好几款使用大规模平行循环芯片测序技术的测序仪得到了广泛的应用。这几款测序仪虽然使用的 技术有所差异，但是在测序数据的质量和数量方面都有着同样的特征，因此也都面临着同样的试验设计、数据分析和注释的问题。不过，这些新一代测序仪将以往的测序费用降低了好几个数量级。鉴于此，以前只有大型测序中心才能够开展的项目，现在在小型实验室里也能顺利进行了。由于新一代测序仪的出现，测序研究领域 也开始升温，有些研究团队正在努力开发新的测序技术希望能够取代现有的新一代测序仪。按照目前的发展速度，我们很难估计几年之后的情况。不过，能够预计的 是，下、下一代或者说是第三代测序仪一定会像十年前的芯片技术一样，迅速地普及开来，从而成为常规的技术。希望人们不仅关注测序技术本身的发展，更加关注 如何利用测序技术来揭开生物学和医学上的众多谜团。
原文检索：
Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10):1135-1145.
Jonathan
M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of
454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 1117-1124.
四、新型纳米孔测序技术
新型纳米孔测序法（nanopore
sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可
以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链
DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如
果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费
1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。
一个盛满电解质溶液的容器被一纳米孔膜隔成两半，如果施以比较小的电压，如约100mV电压，就能使用标准的电生理检测手段测量通过纳米孔的电流大小。很多生物电通道的开关都是靠小肽段分子是否堵塞通道来实现的。基于这个事实，加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz, UCSC）的Deamer和哈佛大学（Harvard University）的George Church都不约而同地提出一个构想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某个通道，那么应该可以运用上述方法来检测电流。接下来，Deamer和 Branton等人证明了单链DNA和RNA分子能通过蛋白质组成的孔道，并且能检测到它们通过这种纳米级孔道时所造成的电流改变（图8a）。他们使用的孔道蛋白是金黄色葡萄球菌α溶血素（Staphylococcus aureus toxin，α-hemolysin）。这种蛋白以前曾被Bayley小组用作生物传感器。Bayley小组发现，α溶血素蛋白非常稳定，即使在接近100℃的情况下也能维持正常的功能。Deamer和Branton等人发现，因为α溶血素蛋白孔径非常小，简直与单链核苷酸的直径相差无几，所以可以将 折叠卷曲的核苷酸链解开，并仅允许它以单链的形式通过蛋白孔道。单链核苷酸分子穿过蛋白孔道时会造成局部电流改变，即相比没有分子穿过时的电流强度有所减 小。基于这个现象，Deamer和Branton等人猜测，如果核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时都能出现一种特定形式的电流改变，那么通过分析电流改变 的情况不就能知道核酸的序列了吗？
为了验证这个想法，Deamer小组、Meller和Branton小组使用好几种不同的RNA分子和单链DNA分子进行了研究，以观察它们对电流 的影响。结果发现，polyC RNA分子引起的电流强度下降比polyA RNA分子要强得多。此外，他们还发现，由30个A和70个C组成的RNA分子在序列从A转变成C时电流强度也会发生改变。不过不幸的是，这种嘌呤和嘧啶之间的明显差异没能在脱氧核糖核苷酸试验中发现。实际上，在RNA试验中观察到的polyA和polyC引起不同形式的电流改变是由碱基堆积（base stacking）和二级结构上的差异造成的。随后，使用不同DNA同聚物（DNA homopolymer）进行试验发现，脱氧嘌呤寡聚物（deoxypurine oligomer）和脱氧嘧啶寡聚物（deoxypyrimidine oligomer）引起的电流改变差别并不大，只有不足5%。而且这种电流改变差异是由10~15个核苷酸（占据了α溶血素蛋白的跨膜区）引起的，它无法 区别单个核苷酸引起的电流改变之间的差异（图8a）。
