CD34阳性细胞计数-1
外周血现已被广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞（Hemotopoietic Progenitor Cells HPC）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用自体移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来源有着以下优点：1，易采集；2，对供者无需全身麻醉；3，减少了采集后并发症的发生；4，受者造血系统重建快；5，费用低；6，住院时间缩短或可部分或全部在门诊处完成操作。
相对于骨髓，外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰，其数量取决于供者血体积和/或单个核细胞的数量。由于外周血中造血干细胞含量很低，固常规中运用多极分离技术来收集这些细胞。在早期临床研究中，收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚。因为要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验，但此法明显不适用于临床，因其大致需要12-15天时间出结果，故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求。此问题自发现CD34抗体可鉴别造血干细胞，并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了。
CD34+造血干细胞植活最低数量要求是2-5 x 106/公斤体重。然而正常人外周血中干细胞数量只占所有有核细胞的0.1%。很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的，除非使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集。此技术可通过给予供者集落刺激因子（通常是粒或粒-单集落刺激因子），同时可联合骨髓抑制剂（如环磷酰胺）的方法动员造血干细胞进入循环外周血中。联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑制，随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞、造血干细胞至外周血，从而达到动员干细胞的目的。联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间，相对于单独使用集落刺激因子可增加动员至外周血中的干细胞。对于正常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血，常使用G或GM-CSF、血小板刺激因子来动员。关于如何使用动员药物请参见其他相关文献。
早期外周干细胞计数
在尚未应用流式细胞仪定量检测CD34+细胞时，外周血干细胞计数常运用单位-粒/巨噬细胞集落形成实验间接求得。这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的数量，故被认为是检测是否存干细胞的金标准。但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有很好的相关性。因为在这项技术中，各研究单位缺乏统一的检测标准；刺激因子不同的处理方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性。常规体外集落形成实验主要检测髓系祖细胞并要求大约14天取得结果，使得该项检测无法来确定临床何时采集干细胞；所以以前只根据循环血中的最大集落数（CFU而非CFU-GM）来确定采集多少细胞。
使用CD34识别造血干细胞
自从发现、纯化、标记抗CD34单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在外周血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞成为了可能。CD34抗原存在于各种祖细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮细胞上也有表达。CD34抗原的分子量为105-120KD，具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构。内皮细胞的CD34抗原与L选择素结合，然而造血干细胞上的CD34抗原的配体至今还未发现，有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用。通过与不同特异性的Vibrio cholera神经氨酸苷酶和Pasturella hemolytica起源的糖蛋白酶作用可区分出此抗原的不同位点。这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为I，II和III 类，最近有报道I和II类抗原应属同一家族，因为它们具有相似的抗原结构和功能属性。这些研究都是基于交叉封闭实验的，故不可作为评价抗体结合效率或抗原空间结构之用。II类抗原位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构，四周由在远N未端组成CD34的I抗原的类糖酶结构环绕。尽管I类与II类抗原几乎合二为一，但它们化学和物理性质是不同的．
Siena领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测CD34+造血干细胞的含量，来决定动员干细胞及采集最佳时间，并研究CD33在干细胞上的表达与移植效果的相关性。CD34阳性细胞运用SSC与CD34双参数流式点图来检测。在此项研究中发现所有的CD34阳性细胞均与形成CFU-CM集落相关；并证实CD34+细胞计数是决定干细胞采集时间有效方法。此外，Fritsch及其工作组发现CD34阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和CFU-GM和CFUGEMM检测的集落形成能力有相关性。这些结果被其他学者相继证实，并使流细胞仪成为定量检测CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的有效、精确的工具。
尽管以前工作已证实造血干细胞表达CD34抗原，但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚开始。Siena及其工作组发现CD34+CD33+双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性。同时Tertappen注意到骨髓中提取的CD34+CD38-阴性的细胞在IL-3，IL-6和GM-CSF刺激下能够形成最原始的集落；随着CD38抗原的增加，CD34阳性细胞形成这种原始集落的能力下降。在CD34+细胞中，CD34+CD38-表型的细胞占1.0%左右。随后又发现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起着重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数CD34阳性细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的信息，所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标。此外可发现、鉴别更新的一些干细胞抗体来提供更为直接的检测方案，如：ACC-133和F84.1。
在达到一个稳定、长期的移植成功的疗效中，CD34+阳性细胞最少需求量方面还存在争议。Bender发现大约2x106 CD34+细胞/公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率。在许多病例中，这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到。Bensinger及其工作组发现CD34+阳性细胞与血小板、粒细胞重建时间有很强的相关性，并建议CD34+细胞最佳剂量是5x106/kg。一个对692例自体移植病例研究也得出了相似的结论。
在移植前处理治疗中，病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况，Tricot等观察225例接受PBPC移植的病例和经PBPC输入治疗了难治性骨髓瘤患者，发现以上因素使自体移植中CD34+细胞的最佳剂量各不相同。此研究表明，对于移植前接受化疗少于24个月的病人，快速植活剂量应>2.0 X 106 CD34+细胞/kg；对于长期接受全身化疗的病人（大于24人月）最低剂量则为>5.0 X 106 CD34+细胞/kg。此处接受短期化疗的病人更容易、快速地取得CD34+细胞。总而言之，这些研究表达2-5 X 106 CD34+细胞/kg的剂量对于大多数情况下是足够的，但也有研究表明更高剂量的CD34+细胞移植能够帮助病例更容易克服组织相容性问题。以下将要讨论有关CD34+细胞的检测技术，有些推荐剂量之间的差异正是由于检测方案不同所引起的。
CD34检测方案变异系数及其标准化
流式细胞CD34干细胞计数为成为应用广泛的实时检测PBPC是否足够移植的有效方法。对动员后供者循环外周血中CD34+细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量，并越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞。根据CD34阳性细胞在样本中的含量将决定是否继续给予生长因子刺激、采集是否继续。每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行3-4个小时的干细胞分离过程，采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行低温保存。从治疗时间及消耗资源的意义上来说，以上动员、采集过程的费用是非常昂贵的，对于有经济困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例。在早期的研究中，干细胞动员方案还未被应用，运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标；有时会为单个病人采集相当于现在20倍数量的细胞用于移植，这不仅会增加标本保存成本，还会带来病人体液过量的临床问题。CD34+细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题，但它也带来许多新的疑问。
米兰方案
第一个广泛应用的干细胞计数方案是由Istituto Nazionale Tumori in Milan的Siena等人创立的米兰方案（Milan Protocol）。在此方案中，需准备三管50 ul的血样或leukapheresis样本（如白细胞计数小于150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中一管留出不作染色，一管加入15ul的抗CD34和CD33抗体，第三管则加入15ul的抗CD2/CD19抗体（计数T、B细胞）。细胞在4℃下避光孵育25分钟，之后加入红细胞裂解液。孵育15分钟后加入不含钙、镁离子的PBS洗液300g 离心7分钟洗涤，如果红细胞裂解不彻底则可重复裂解过程。弃上清后细胞可在4℃保存并于一小时内上机检测。在光散射参数中分析所有细胞，建立门圈定所有白细胞（排除碎片），并设立一门去除有自发荧光的细胞。在调节完补偿后，分析10000个细胞，CD34+细胞可通过低SSC信号和CD34阳性表达加以区分。CD34弱阳性细胞一般不分析。
目前有很多米兰方案的改进版，分别从：运用不同的CD34抗体、不同的溶血技术、加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用CD45抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细胞等方面进行改进。运用这些技术后，报道的移植所需足够的并且能快速完成的CD34+细胞数量有着巨大差异。经过仔细研究发现这些差异是由于在CD34细胞计数过程中运用了不同的标本处理、染色和分析方法造成的。因为在未动员的正常外周血中，CD34阳性细胞通常小于全部有核细胞的1%，在经G-CSF动员后志愿者外周血中会大于5%（有时在用血小板形成因子动员时可大于20%），对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战。特别在计数小于1%时，又要做出检测来决何时进行采集时，精确计数显得格外重要。
Multi-Center方法研究报告
Multi-Center研究所在北美、欧洲、澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在的储多问题逐步浮出水面。其中的一些问题最先在法国马赛招开的欧洲外周血干细胞计数研讨会中提出。在此次会议中，讨论了临床的CD34计数的价值与在各种检测方案中所应用的不同技术。并就外周血干细胞计数标准方案达成了一致。推荐方案中要求标本需预先作白细胞计数，用来染色的标本体积根据对CD34+细胞数量估算来决定，分析时要求收集足够的有统计学意义的标本数量。方案中推荐使用双标记方法染色，其中包括将2 ul的PE标记的CD3抗体和10ul的FITC标记的CD34抗体（QBEnd10）加入250ul的全血进行染色，室温下孵育20分钟，每5分钟用移液器吹打混匀一次；随后加入Ortho公司的红细胞裂解液孵育9分钟，每3分钟震动混匀一次；之后细胞在300g离心三分钟洗涤一次并用PBS重悬。使用改进的米兰方案进行检测，在光散射图中设门去除死细胞和碎片后分析50000个细胞。如果CD34阳性细胞计数小于0.1%，则需进一步分析，运用FL2设门去除CD3+细胞群体和散射图中设门去除单核和粒细胞后再次分析。
马赛干细胞会议发展并拓展了一系列干细胞生物技术、干细胞计数和临床应用方面的欧洲协作组。其中最为重要的是，Sovalat等人向22个实验室发送了新鲜的白细胞采集样本和相应检测单抗供染色与分析。由于使用了不同的检测技术得出了变异很大的计数结果，其变异率达15-100%。对染色方案中最具统一性的步骤是运用同型对照来去除非特异性染色。使用FITC标记的CD34抗体，克隆号为8G12的其结果范围为0.00-1.29%，QBEND10抗CD34的抗体为0.17-17.8%。其中一个中心运用8G12测不出任何阳性颗粒，五个实验室报告QBEND10抗体测不出任何结果。运用PE标记的CD34抗体，结果的变异性要小得多，然而根据资料发现8G12抗体检测的结果比QBEND10的结果变异率要高。只有一个实验室报告使用QBEND10无法得出检测结果。
英国流式细胞仪临床应用协会开展了更为广泛的研究，在此项研究中共分别向15个单位分两次派送了总共28份的白细胞采集品，其中CD34+细胞的含量为0.08-19.31%，由此可得出检测结果在实验室内和外的变异率。每个样本实验室都按自己的计数方案进行检测，随后数据统一汇总。CD34阳性细胞的含量检测结果的最大CV为100.1%，绝对计数的CV为136.6%。
随后Multi-Center分析方法的应用系统地衡量了在CD34计数检测中的变化因素，其中包括：样本的运输、准备、染色、收集和分析。虽然其中涉及了很多因素很难分析，但依然发现许多关键问题所在。一项在北美10个研究单位中开展的实验中，Brecher将21份已洗涤的骨髓或PBPC样本重复送至各研究所，并用其自己的方案染色和分析。其中三家单位应用统一的检测方案。CD34含量检测结果的变异数使用每个送检样本所得结果的最大值与最小值来表示：范围为2.9至749，中位值为76。如去除其中两个实验单位报告的最高结果，变异范围缩小至1.2至27之间（中位值为3.1）。在那些将方案标准化的实验室中，其变异范围为：1.2至4.4之间。在重复性方面，最小变异范围为0至16.5，最大到4.1至133（这个单位只分析了10000个细胞）。在CD34绝计数中的变异范围则是“令人惊恐的”。如此巨大的变异是主要由于设门方案的不同引起的，并能通过使用标准化方案减小差异。澳大利亚的一个Multi-Center研究组证实这个结论，他们将PBPC标本派送至20家参与单位用其自己的方案进行检测。CD34+细胞的比例范围为0.64-2.80%，中位数为1.54%。20家参与单位中，其中9家的结果在中位数的10%范围以内。将List mode文件给予24家参与单位并用其自己的方案分析，发现其差异主要由所用的分析方案不同造成的，有17%的单位检测结果超出中位数10%范围；当所有参与单位统一使用相同的分析方案则只有0-7%的单位超出10%的限制。最具统一性的方案是ISHAGE多参数分析方案，所有参与单位分析结果全部落于中位数的10%以内。
在一项由Lumley组织的研究中，他将冷冻保存的白细胞采集品在冷藏条件派送至8-12家参与单位分析其中CD34阳性细胞的百分比含量。研究的第一步是将12份标本送至8家参与单位，每家单位使用其自己的染色、分析方案（基于米兰方案）进行检测并获得结果。对所有结果汇总统计发现其CV值为50-235%，在统计学上有显著差异，其中一家单位的结果显著地与其他单位检测结果差异的5%水平。第二步研究是将另外12份样本送往12家参与单位，每家单位使用克隆号为HPCA-2，PE标记的CD34抗体，并用FITC标记的CD45识别白细胞，收集50000个细胞，但实际中有27%的单位没有收集如此多的样本进行分析。对全部结果汇总分析后，其CV值为23-127%，虽仍具有统计学差异，但没有哪家单位的结果与其他单位结果的差异在5%水平。此时，去除那些≧2SD平均值的结果，发现这些值都出于同一实验室。经汇总统计发现，使用标准方案得出的结果降低了结果的CV值：由第一阶段的平均CV值137%降至第二阶段的平均CV值69%。但这也可能是因为第二次计数获得的检测结果比第一次高（第二阶段1.92% VS第一阶段1.23%）造成的。此研究表明各个实验室之间CD34计数结果的CV值仍过高以致于无法比较各个实验室所检测值。
