CD34阳性细胞计数-2
其他研究组也对影响计数结果的因素进行了广泛的检查，如通过提供统一试剂或发行标准分析方案来进行。尽管这些研究减少了一些检测差异，但要进一步地提高实验的精确性需对各个检测中心进行全面的培训并发展标准的计数方案。此项工作由Nordic Myeloma研究组广泛开展，他们组织了两个协作组来制定计数标准方案并在24个实验室中进行来提高CD34计数的准确性。第一次协作工作主要集中于标准化标本处理方法；其间制定了一样本处理的标准方法：要求样本在4小内分析；使用Ortho溶血剂与标本孵育8至10分钟溶血；5-10 x 105细胞与克隆号为HPCA的PE标记的CD34抗体室温下孵育15分钟，同型对照同等条件处理；洗涤2-3次后用150ul 1%的多聚甲醛固定。用米兰方案识别低SSC信号的CD34阳性细胞，共分析50000个完整细胞，并减去同型对照阳性颗粒的数量。
在第二次协作中，Nordic首先向参与单位分发了含有三个病例List mode数据的磁盘供分析。发现在参与单位之间的分析结果差异很小（如对于含有0.29%和1.36%的两个样的标准差分别为0.04和0.17）。随后参与单位又收到了先染色后固定的和还未染色的两种样本。随后对24家参与单位的22家结果分析表明结果比较一致（r>0.9），尽管其中有实验室一直报告较高或较低值。在三阶段中，参与单位要求使用第一次协作中制定的标准方案来检测送检样本。结果显示CD34计数的平均值为0.68%，标准差为0.08。使用更为统一的方案来检测下一标本时，其平均值为3.0%+0.26，范围是2.6-3.3%。最终的推荐方案是：溶血步骤可在染色前或染后进行；加与不加鼠IgG来封闭非特异染色不影响结果；如果检测中发现有非特异性染色，则需阻断后再进行检测；无需对样本进行过滤；孵育与分析之间样本最好只洗涤一次。为了绝对计数CD34细胞，需对样本进行10倍稀释后进行白血胞计数。
应用标准化方案来计数CD34细胞在Benelux的研究中进一步被证实。实验室之间在未用标准方案前的检测变异系数34-106%在应用标准方案后下降至18-30%。错误应用方案后，变异系数又增加至50-82%。
这些研究表明，在CD34计数检测中有众多因素影响着计数的准确性。这些因素可通过以下操作步骤来去除这些影响：1，尽量减少对样本处理步骤；2，使用适当标记的抗体；3，选择适当的阴性和阳性标本；4，收集足够的细胞数来降低变异系数；5，采用标准设门和分析方案。但以上任何一条现都没国际上通用的标准，很清楚我们需要为CD34干细胞计数设立一广泛同意的标准来减少其中的变异性。现将一些标准总结如下。
样本准备
现有很多种方法运用于干细胞计数的样本准备及分析中。在早期研究中，细胞经常经Ficoll淋巴细胞提取液来富集单个核细胞，然后反推外周血或采集品的细胞比例。这种计算方法经常会得出不精确的评估数据，但能部分地反映标本中的细胞量。Fritsch报道单个核细胞分离操作会导致外周血中26%的、骨髓中21%的、采集品中5%的CD34+细胞丢失。现在基本弃用单个核细胞富集法，而改用对全血进行溶血来去除红细胞。在这个操作步骤中，在未经处理的标本中直接加入荧光标记的CD34抗体进行染色，通过加入溶血剂溶解红细胞的步骤可在染色前或染色后进行。这样使经血球仪计数的白细胞数与流式细胞仪经CD45设门后计数的白细胞数更容易比较。一个对不同样本处理技术的系统比较发现洗涤步骤会导致部分白细胞群体丢失，从而造成CD34+细胞的过量计数。这种过量计数可通过在溶血后计数白细胞作为分母计算而非在溶血前来纠正。溶血后不洗方法可保存样本中各种白细胞群体，但这样会改变细胞的光散射信号并增加荧光的非特异染色本底。这样就会导致底估CD34+细胞绝对计数。尽管每种标本处理方法都有其不足之处，但本研究推存使用：先裂解红细胞；洗涤样本；进行白细胞计数作为计算分母；最后进行染色步骤。在本研究中，笔者使用不含固定剂的氯化铵溶血剂（Ortho公司）室温下溶血5-10分钟，随后洗涤2次后染色。对于先染色后溶血的样本，要求白细胞数在2000-3000/ul，这样可避免因样本量过大而造成染色和分析时间加长；样本在此法处理后无法再进行白细胞计数。相比而言，溶血/洗涤法可预先获知样本的白细胞数并能够分析原样中白细胞含量小于50 /ul的样本。
溶血剂
通过对不同溶血剂（FACS Lysing solution Bection Dickinson; Immunolyse Beckman-Coulter; Optilyse B Immunotech, ImmunoPrep Beckman-Coulter；OrthoMune Ortho; ACK BioWhittaket）的比较发现它们的效果各不相同。各染血剂溶血后CD45阴性碎片占总颗粒数百分比为：ACK，Immunolyse: 80%；其他溶血剂大约为50%。Optilyse和FACS溶血后淋巴细胞比例最低，当使用ACK和OrthoMune后CD4和CD8阳性细胞比例不稳定，但所有的这些溶血剂都能使CD34阳性细胞明显地与阴性群体相区分。对于溶血及固定型试剂的检测也得出了相似的结论。这些观察结果显示溶血剂并不象我们所认为的对CD34+细胞计数无影响。要避免延长溶血时间，除非标本已置于冰上停止了溶血。
样本问题
有些样本可能存在某些特殊问题。血小板可能会与CD34+或CD34-细胞结合影响精确计数。这个问题可通过增加EDTA来解决。聚集的血小板可能会与CD34、CD45抗体微弱结合，但可通过巧妙的设门方案将其去除。
样本的储存及运送
越来越多的采集品因要合并或体外富集或要被运送至流式检测中心，样本都需被过夜保存。在以上这种情况下，样本中细胞群的活性和被分析细胞潜在的改变等问题逐步显现出来。现在对这些细胞最佳的存储及运输条件现在还未明确地建立。各个实验室对标本保存温度从室温至4℃不等；加或不加营养剂都有。不同的标本盛放容器和一些与血小板集聚有关的因素现已被严格限定。Gutensohn报道采集品在室温下保存24小时后，用HPCA-2和QBEND10两种克隆号的单抗检测发现CD34+细胞分别下降了25.4%和27.0%。样本在运输过程中的晃动会增加大概10%的抗体非特异性染色，主要是由髓系细胞和死细胞造成的。相对而言，如标本储存在4℃条件下，CD34+细胞不会有明显下降。尽管现在低温运送标本已变得可行，但一些冷冻剂会影响细胞表面抗原的表达。Rosillo等人报道当髓细胞暴露在DMSO中时会使细胞下调表达CD7，CD13，CD33和CD34并且也影响一些其他一些抗原表达强度。但Farley却得出了不同的结论，他发现冷冻剂即不影响细胞的光散射属性也不影响细胞标本中CD34+细胞的比例。现在由于样本被广泛运送检测加之缺乏适当的标本储存和运输知识，又一些抗体会与死细胞起非特异结合，要求对样本进行活性检测来去除细胞中的死细胞。可用的试剂有PI、7-AAD或LDS-751。
CD34抗体的选择
对于CD34抗体及其荧光素的选择现还有争论。最初因缺乏直标的CD34抗体，采用未标记的CD34抗体与FITC标记的荧光二抗来间接检测。这样一来使原本复杂的检测与二抗的非特异结合和如何识别阳性细胞等问题掺杂在一起，更难以处理。随后一系列不同荧光素标记的CD34抗体的出现使以上情况有所改观。这些抗体能与CD34抗原的I、II、III类位点结合，CD34的不同抗原位点可根据其对不同的蛋白水解酶的敏感性来区分。对Vibrio cholera神经氨酸苷酶和Pasturella hemolytica起源的糖蛋白酶敏感的称之为I类位点，针对此位点的抗体克隆号有：MY10，B1.3C5，12.8和ICH3。对唾液酸不敏感但能与PhG粘附的称之为II类位点，识别此位点的抗体是QBEND10。对以上几种酶都耐受的，称之为III类位点，可被8G12、TUK3、115.2等克隆号的抗体可识别。
使用III类位点特异性抗体能最大限度地提高检测的敏感度。这是因为抗体与荧光素结合后，其结构可能会发生改变从而导致一些抗体无法完全检测某些样本中的CD34+细胞。基于以上情况，发现针对I类抗原的抗体此问题最为严重，它在与荧光素结合后，如FITC，即失去活性；此外还发现这些抗体与PE荧光素结合后其特异会严重下降。相对而言，PE标记的II类抗原能够检测样本的所有CD34+细胞，但它一旦与FITC结合后也会丧失一部分结合能力。使用抗II，III类位点的抗体计数采集品与脐带血中CD34+细胞，发现其相关性系数为0.975。现普遍推广使用与III类位点结合的抗体，这些抗体能有效地与多种荧光素结合如：FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5。任何标记的抗体都要仔细观察其是否会有潜在的交叉反应，此外还要注意它们可能会与某些样本中聚集的血小板结合。
对于II类位点的抗体在计数骨髓或外周血中CD34+细胞时，其有效性评价不一。有报道认为QBEND10抗体因其与死细胞的结合而增加非特异性染色且与目标细胞的结合强度也不高，所以它不适合作干细胞计数。但FITC标记的抗体确实存在以上情况，FITC标记的抗体阴性检测结果就能说明这种情况，而PE标记的抗体则正常。
阴性对照
干细胞计数中另一个难点是如何选择一个恰当的阴性对照。一般在流式细胞仪上，选用与抗体标记相同的同型免疫球蛋白作为非特异性染色的本底，但这种方法没有体现针对具体抗原的非特异性染色的情况。在用CD34抗体染色的标本中，目标细胞群可能少于总细胞群的0.1%；而只有目标细胞群大于1%时才合适用同型作为阴性对照，这样就很难区分检测管中的阳性细胞是特异性染色或非特异性的。
另一种可选方案是采用多参数设门技术来区分特异性结合群体。通常CD34阳性细胞同时也表达CD45，并且这些细胞的光散射信号也有其特征。在CD45/SSC双参数图中，CD34阳细胞与淋巴、单核、粒细胞相分离独立成群。平行对比实验发现用多参数设门检测的阳性细胞中不含有荧光标记的同型对照阳性的细胞。实验表明多参数检测或结合逻辑设门将成为一标准，特别是在运用定量技术检测特殊的染色细胞群体时。这个方案要检测样本中的极少数细胞群时显得格外重要。
有学者建立了另一阴性对照方案，他将已与未标记的CD34抗体孵育后的标本再与荧光标记的CD34抗体孵育，此时阳性的细胞则算为非特异性染色。但考虑到未标记的CD34抗体也存在非特异性染色，可能会覆盖标记抗体的非特异性染色。此法还未与同型对照作过比较。
阳性对照
在临床检测中需要检测阳性样本，据此来检查操作过程是否正确，并可作为质控。在CD34检测项目中，要取得易制备、稳定可靠的阳性标本并非易事。现有几种制作方案被实验室接受。阳性标本一般使用各种表达CD34抗原的细胞株来制备。运用最广的是KG1这强阳性表达CD34的细胞株，当它被加入至临床样本中时，不会影响原样本中的各细胞染色属性（Coulter和R&D公司的质控试剂使用的就是这种技术）。由于这些细胞形态较大有其特有的光散射属性，它们作为CD34+细胞加入未动员的全血中并不能很好的模拟真实的样本，从而使检测质控样本的方案不能适用临床样本。虽然有可能从一个长期志愿者身上抽取样本作为质控，但由于无法得知其真正的阳性细胞数，又该法很难常规单位实行所以并不理想。以上问题可通过收集同一个具有高和低CD34+细胞数病人的标本，将其分装后冻存。冻存后的样本在光散射信号与CD34表达上与新鲜样本比较一致。每天可检测一管解冻扣的样本作为阳性质控品。当使用这些样本作质控时，要检测样本中细胞活性并要使用多参数方案来减小差异。
在美国，临床实验室中的操作技能考核也要同时进行，这些考核标准由若干家研究机构的临床流式实验室共同制定，其包括College of American Pathologists和PTP。这些测试是在正常样本或白血病样本上进行的，而不使用CD34+的血细胞样本。这是由于各个实验室对CD34+细胞计数报告的给果差异实在太大，又不能找到大批量、稳定的、已了解清楚的样本来进行考核。如能够制备出抗原染色稳定、适用面广、储存方便、使用效期长的质控品，则以上问题可得到解决。如以上任务能达成将能加速发展能减少实验室间与实验室中变异的实验技术。今后或许可使用流式标准微球来达成此目的。
样本获取
另一个值得注意的问题是在干细胞计数中要分析多少个细胞。传统实验中，如分析目标在白细胞群体中，一般采集5000至10000个细胞分析。但当进行CD34干细胞计数时，由于CD34+细胞一般只占1%整单个核细胞，固可将其视作泊松分布曲线，如要得到一个变异系数为10%左右值，就要采集100个阳性细胞；采集的细胞数量要根据CD34细胞的比例来决定。尽管理想状态下，应对每个样本采集尽可能的细胞进行分析，但鉴于标本细胞的数量、流式所有软件的功能、和数据的存储空间等因素的限制而无法做到。普通实验室一般在未设门的光散射图中收集50000至75000个细胞进行分析，来获得一个比较精确的结果。在分析过程可通过设门排除死细胞，但一旦去除这些细胞会使其后所分析的细胞群体数量减少。
数据分析
如上分析所见，要检测阳性细胞需要进行双参数或多参数分析。后者多参数分析有助于排除样本中CD34弱表达群体，其可能包含细胞碎片或其他非干细胞颗粒。许多实验室还加检了CD38、CD33和CD90来进行一步计数更为原始的干细胞，或来寻找与临床移植效果更有相关性的细胞群体。这种分析要求流式操作者具有更多的操作和统计技巧。现有很多分析方案可用于此目的；其中一些是基于原来米兰方案修改而来，它是通过CD34/SSC设门去除细胞碎片、红细胞和聚集物；阳性颗粒需要满足：CD34阳性表达，SSC信号较弱，细胞独立成群。有学者使用7-AAD染色去除死细胞，用CD14去除单核细胞的方法来分析。首先设门选取7-AAD阴性的细胞，并将其显示在CD34/CD14双参数图中并从中去除单核细胞；在此方案中，可将CD34阳性细胞再次显视在CD34/SSC图中分析并与相应的同型对照作比较。随后对于以上方案又有修改，将CD45替代7-AAD设立白细胞门，后进行分析。
ISHAGE方案
Sutherland于1994年在它的研究使用与以方案相似的手段分析，随后此方案被ISHAGE收录作为推荐方案使用，旨在确立一个普遍通用的、可排除实验室中或实验室间差异的方案。这个方法是由门不断累加来完成的。第一个门是基于CD45/SSC双参数图上的；通过对其设门可去除红细胞、碎片、和聚集物，这些干扰在造血细胞样本中尤为多见，特别是在样本使用溶血-免洗法处理后。通过此步骤也为以后计算CD34阳性细胞比例提供了可靠的分母（总白细胞数量）。在R1门中，最少要包括75000个细胞，并在R4门要计数超过100个CD34阳性细胞。将通过R1门获取的细胞显示在CD34/SSC双参数点图，在此图中设立R2门并调节其位置包含所有CD34强阳性或弱阳性的并SSC信号弱及中等的细胞。建立一CD45/SSC双参数点图，将以上CD34阳性细胞显示于其中；在其中设门R3门去除CD34阳性颗粒中的聚集血小板、淋巴细胞和单核细胞。将R3门中圈定的细胞显示在FS/SS图中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞门R4中，通过R4要去除比淋巴细胞小的颗粒。（注：如何确定R4门的位置呢？方法如下：在CD45/SSC双参数点图中设立R5门圈定CD45强阳性且SSC低信号的淋巴细胞群体，将R5门中的细胞显示在R4门所在的FS/SS双参数直方图中，根据其中的淋巴细胞的位置调节R4门，确定R4门在FS和SS轴上最小值的最低范围。）在脐血标本中，会出现CD45/CD34双阳性的血小板集聚颗粒，但它们的侧向散射光弱于真正的CD34阳性细胞，可被处于幼稚淋巴细胞位置的R4门排除。最终在R4门中读取CD34阳性干细胞计数的数值。此时如检测CD45/ISOTYPE双染的阴性对照，在ISHAGE方案设门分析，在R4门中几乎不见非特异性染色的颗粒存在。如在某些情况下R4出现非特异性染色颗粒，则在样本计数时要从R4门减去非特异性染色的细胞数。
对于此方案有一争论，是否所有CD34特异性染色的颗粒CD45都是弱表达。这了解决此疑问，在仪器调节和设门方面又作了改进，两个独立的直方图被加入上述的四图型方案中。在第个直方图中增设R5门来精确圈定淋巴细胞：CD45强阳性且SSC低信号。并将这些细胞显示在第6个FS/SS双参数直方图中。据此可确定R4门的圈定幼稚淋巴细胞最小范围（第4个直方图为第6张的拷贝）。这样就能最大限度地去除血小板、未裂解的红细胞、和其他碎片。这张直方图还可以确定FS的预值设置是否适当，FS和SS的电压设置是否足够。因为在此图中要确保CD45阳性的最小淋巴细胞能够适当地在FS/SS图中显示出来。建议最小淋巴细胞的FS参数强度在1024线性坐标上，位于200左右的位置上。当FS/SS的电压及域值都设置完毕后，调整第1直方图中R1门的位置，使其包括所CD45弱阳性和阳性颗粒。R1门在CD45从标的下限则根据以下直方图来确认：建立第5张CD45/CD34双参数直方图，根据CD34阳性颗粒的CD45表达的最小值建立十字门，确保所有CD34阳性CD45极弱表达的细胞全部在CD45设定界线的左侧；然后根据此进的CD45界线位置确定R1门的最小值。
CD34+细胞百分比检测可通过对白细胞决对计数转换成CD34+细胞决对计数。在原有的ISHAGE方案基础上，在第三或第四荧光通道中检测已知数量的标准微球便能达成以上目的。这样就能使无法定量的单平台流式细胞仪变为能直接绝对计数干细胞的精确仪器。ISHAGE方案完全兼容使用7-AAD荧光染料进行样体活性检测，这样就能在样本中绝对定量计数有活性的CD34+阳性细胞。这一点对临床上在检测抽取或合并时间过长的样本时十分有意义。
DNA/RNA染料/CD34PE/CD45PC5+定量荧光微球（PerfectCountR kit for CD34+ Cell Enumeration , Multi Sciences Co.Ltd ）检测试剂盒分析说明
DNA/RNA染料在FL1中检测，用来识别所有有核细胞，在流式细胞仪分析时作为圈定白细胞的基础。
采用标准ISHAGE方法进行CD34PE/CD45PC5染色分析，绝对定量微球BD机器在FL4通道内检测，Coulter机器可在FL3通道内检测。
