MSCs分化为脂肪细胞
MSCs分化为脂肪细胞
试剂和材料：
完全培养基（CCM）：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
FDM（脂肪分化培养基）：①FDM：CCM包含0.5μmol/L
IBMX，50μmol/mlIM和0.5μmol/L地塞米松。②异丁基甲基黄嘌呤（IBMX），1000×储存液，用甲醇配制成0.5mmol/L。③吲哚美辛（IM）：1000×储存液，用甲醇配制成50mmol/L。④地塞米松：1000×储存液，用水配制成0.5mmol/L；
PBSA；
胰蛋白酶/EDTA；
聚丙烯离心管，15ml和50ml；
组织培养皿，6孔，孔面积为9.6cm2；
0.85%台盼蓝盐溶液；
中性福尔马林缓冲液，10%；
ORO工作液：ORO用异丙醇配制成1%，3份。PBSA，2份。70μm细胞滤网过滤；
改良的Neubauer血细胞计数器；
实验方法：
从单层细胞中收集MSCs；
向6孔培养板的每个孔中加入2ml CCM，共有1×105个细胞（适用于人或大鼠）。最终密度约1×103个细胞/cm2；
将上排3个孔标记为“成脂”，下排3个孔标记为“阴性”；
在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基，直到细胞达到7.%—80%汇合；
达到所需的细胞密度时，从孔中吸出完全样机，向6孔培养板上排的孔中加入2ml FDM，向下排的孔中加入2ml CCM；
在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基。ORO检测时，于21天对细胞进行染色；
从培养箱中取出分化后的MSCs，每孔中的单层细胞用2ml PBSA润洗两次；
每孔中加入2ml福尔马林，室温固定单层细胞10min；
吸出福尔马林，每孔中加入2ml PBSA润洗两次后，再用2ml蒸馏水润洗一次；
加入2ml ORO工作液，室温孵育30min；
过量PBSA润洗各孔，直到“阴性”孔中的背景染色最大限度地清除；
用显微镜观察标记为“成脂”的单层细胞评价脂滴的染色程度。成脂分化达到令人满意的水平时，单层细胞ORO着色面积超过30%。此时，单层细胞可在4℃ PBSA中最多存放7天。或者，将ORO从着色的单层细胞中提取出来，用先前描述的方案进行测定；
