人类基因组DNA提取的原理和方法
实验目的:
1.熟悉分子生物学实验的操作特点。
2.掌握人类基因组DNA提取的基本原理。
3.熟悉人类基因组DNA提取的基本方法。
4.熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。
实验原理:
用细胞裂解液裂解细胞膜,收集细胞核,加入SDS破裂核膜,用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来,经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质,无水乙醇沉淀DNA,75%乙醇洗涤DNA沉淀,真空干燥后,溶解于TE中即得到高分子量的DNA。
本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后,用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来,并使用RNaseA降解RNA,再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性,可快速、高效地纯化回收基因DNA。
操作步骤:
细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化
1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中,再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液,用移液器来回吹打混匀,室于55℃温浴35分钟,其间来回颠倒离心管几次,直至溶液呈水溶状。
2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8),随后加入1250 μl结合缓冲液,充分振荡混匀,12,000 rpm离心30秒。
DNA与吸附柱结合
3.用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱(套好收集管)中,放置1分钟,12,000 rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。
注意:待转移上清约1300μl,离心吸附柱容量约650 μl,故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中,离心,倒掉收集管中的废液,重复实验操作步骤3。
DNA的纯化
4. 再加入600 μl洗涤缓冲液(washing buffer)到离心吸附柱(套好收集管)中,12,000 rpm 离心30秒。
5.重复步骤4一次,12,000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。
6.小心取出离心吸附柱,弃收集管,将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管,并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中),放置1分钟,于12,000 rpm 离心30秒。
7.取出Eppendorf 离心管,其中便是所提取基因组DNA。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
8.取8 -10μl基因组DNA,并加入2 μl上样缓冲液,混匀,加样到1%琼脂糖凝胶点样孔中,电泳。
