肿瘤细胞的荧光免疫表型和 FISH 共分析实验
| 实验材料 | 正常鼠血清 鼠单克隆抗地髙辛抗体 鼠抗 FITC 抗体 AMCA-亲和素 FITC-亲和素 生物素化山羊抗亲和素抗体 Cy3 标记的亲和素 Cy3 标记的山羊抗鼠抗体 Cy3 标记的兔抗山羊抗体 Cy3 标记的驴抗兔抗体 Cy3 标记的兔抗鼠抗体 地高辛标记的山羊抗鼠抗 FITC 标记的驴抗鼠抗体 FITC 标记的山羊抗地高辛抗体 缓冲液 SSC |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 单克隆鼠抗人抗体 人 Cot-1 DNA 人胎盘 DNA 硫酸葡聚糖 Sephadex 050 分离柱 超声破碎的鲑鱼精子DNA 70% 、85% 和 100% 乙醇 橡皮泥 去离子甲酰胺 DAPI (4 6-二氨基-2-苯基吲哚） DABCO (2 2 2-三乙烯-1 4-二胺） |
| 实验步骤 |
一、标本制备
同时进行免疫表型和 FISH，可以使用细胞离心制片、涂片、印迹或冰冻切片。适当的操作和保护细胞完整是成功完成这部分实验的关键。一般来说，新鲜制备的标本片应该晾干过夜 再转入-20°C 或一 80°C 保存。低温下标本片可以保存数周甚至数年。自冰箱取出后，标本片应在室温下解冻，并晾干后再使用。使用前，应该在相差显微镜下检查细胞的形态和位置。下面 是细胞离心制片的制作方法。
1.将机体组织如淋巴结或实体瘤组织在 PBS 缓冲液中用剪或刀切成小块。
2.收集得到细胞悬液。
3.200 g 离心 IOmin。
4.弃去上清，PBS 重悬细胞。
5.细胞计数。
6.调节细胞浓度至 IXlO4 个/mL。
7.取 200, 细胞悬液加入细胞离心机，200 g(800r/min) 离心 5 min。
8.晾干标本片过夜或室温下放置至少 2 h。
9.-20℃ 保存标本片。
二、免疫表型
根据需要解决的问题，进行一两次免疫表型实验。下面是两种实验方法。
单抗原的免疫表型
16.70%、85% 和 100% 梯度乙醇脱水，每次 3 min，晾干至少 lOmin，预备进行 FISH 实验（见上述的 3.3)。
双重免疫表型（如 CD4 和 CD8)
第一抗原的免疫表型
第二抗原的免疫表型
三、FISH
DNA 探针制备
多拷贝探针
许多多拷贝探针已经商品化，如 Vysis。一般实验使用杂交 mastermixI，但是如果是商品探针，建议按照生产商的说明书进行实验。
单拷贝或特异位点 DNA 探针
这些探针克隆在不同的载体（从噬菌体到 BAC、PAC、YAC) 上。DNA 用生物素、地高辛或突光染料标记后，探针离心缩小反应体积。杂交 mastermixII 可用来溶解探针。一些商品探针，如涂染探针，也可以用这种方法。按生产商的建议进行探针制备，例如，自 Vysis 购买的 DNA 探针，IfjtL 直接标记探针应加入 2pL 去离子水和 7pL 提供的 CEP 杂交缓冲液。
DNA 标记
我们推荐使用 LifeTechnologies/Gibco 的 DNA 缺口平移标记试剂盒结合生物素、地高辛或荧光染料，如绿色或橙色进行 DNA 标记。每次反应，IpgDNA 探针在 15°C 标记 lh。标记物经 Sephadex050 分离柱上样后离心。1% 琼脂糖凝胶上样 5|uL 缺口平移标记探针，检测探针片段的长度，长度应为 200?800bp，大部分在 300?600bp。
沉淀标记的 DNA 探针
1.向 I.5 mL Eppendorf 离心管中加入下述试剂，并在-70°C 放置 30 min:5~10ul 标记 DNA、5ug 人 Cot-1DNA、人胎盘 DNA、3ug 鲑鱼精子 DNA、1/10 体积的 3mol/L NaOAc(pH5.2) 和 2.5倍体积的 100% 乙醇。
2.4°C 下 13OOOg 离心 30 min。
3.弃去上清，加入 2 倍体积的 70% 乙醇溶解剩余的盐，13OOOg 离心 10min。
4.室温下晾干。
5.10uL 杂交 mastermixI 或 mastermixII，混匀，溶解探针。
杂交
如果进行的是单抗原免疫表型，将进行双色 HSH(生物素和地高辛探针）。在双色 FISH 中，等量的地高辛和生物素探针一起沉淀，与细胞杂交。当进行的是双重免疫表型时，只要用地高辛探针进行一次 FISH 杂交即可（见注释 5)。
1.2~3uL 含有 DNA 探针的杂交混合物滴加到杂交区域。
2.盖上 12 mm 盖片。
3.橡皮泥封片，让其干燥
4.将标本片放在铺有湿纸巾的金属盒底，盖好金属盒，将其置于 76°C 水浴中 5 min(见注释 6)。
5.将金属盒转入 37°C 温箱。根据 DNA 探针的类型，选择杂交数小时、过夜或几天。重复序列探针，杂交只需要 2 h，而 cDNA 探针或染色体涂染探针，杂交则需要 2 天。
杂交后洗脱
1.除去橡皮泥。
2.将标本片在预热的 0.1XSSC 缓冲液（pH7.0,60°C) 中将盖片轻轻地滑掉（见注释 7)。
3.0.1XSSC 洗片 3 次，每次 5 min。
4.标本片在 PN 缓冲液中于室温下浸泡 3 min。
杂交信号的检测
下述实验方法用于检测双色探针（生物素和地高辛）。同时进行双重免疫表型和 FISH 时，只用地高辛探针杂交。检测生物素探针的抗体的步骤如 AMCA-亲和素和生物素标记的山羊抗亲和素，可以省略（见注释 5)。
1.将 AMC 标记的亲和素和单克隆鼠抗地髙辛抗体（分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释）混合物室温下孵育 25 min。
2.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次，每次 5 min。
3.将生物素标记的羊抗亲和素抗体和地高辛标记的羊抗鼠抗体（分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释）混合物室温下孵育 25 min。
4.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次，每次 51^11。
5.将 AMC 标记的亲和素和 FITC 标记的羊抗地高辛抗体（分别用 PNM 缓冲液 1:100 稀释）室温下孵育 25 min。
6.用 PN 缓冲液于室温下洗片 3 次，每次 5 min。
7.用抗淬灭剂封片。如果实验中只有红绿荧光染料，封片前应将标本片在 DAPI 溶液中染 2 min，2XSSC 漂洗。复染可以帮助确定杂交信号在细胞核中的位置。
四、图像保存和评估免疫表型和 FISH 结果
根据使用的单色、双色或三色荧光滤片系统，免疫表型和 FISH 结果可以同时或依次观察。结果可以用髙速胶片（ASA400) 或数字成像系统进行拍摄。对于免疫表型的结果，分辨真假信号是很重要的。一般来说，真信号明亮新鲜，而假信号则模糊微弱或者极其的明亮。FISH 分析细胞的免疫表型，只能对完整的没有重叠的细胞进行评估。我们一般一张标本可以分析至少 50 个阳性结果细胞和超过 1 〇〇个阴性结果细胞。比较重要的是，结果评估应该由另一个独立的观察者来完成。
注释
1.免疫表型实验中，单克隆鼠抗人 CD 抗体和多克隆 Cy3 和 AMCA 交联抗体都用 PNM 缓冲液以 1:50?1:200 的比例稀释。根据抗体质量和细胞中抗原表达水平确定适宜的抗体浓度。例如，在 T 淋巴细胞中高表达的 CD3 只需要与第一种或第一和第二种抗体孵育就可以轻易检测到。应该对每种新购买的抗体进行对照实验以确定其最适浓度。一般来说，Cy3 和 FITC 是强的可靠的染料，而 AMCA 比较弱，不稳定。Cy3 检测免疫表型的结果可以数周甚至数月后观察，而 AMCA 的信号很快淬灭。FITC 的标本片不能多日后检测，因为细胞的自发荧光将背景染色。
2.免疫表型后再次固定，可以使用 1% 或 4% 的多聚甲醛。多聚甲醛可以在 4°C 储存 2 周以上，而 Camoy 固定液必须每次使用前新鲜配制。缓冲液的固定时间对于成功完成实验非常重要。细胞固定的时间越短，荧光信号损失的越多。然而太长的固定时间将导致 FISH 杂交效率的大幅度降低。
3.免疫表型中，为排除错误的阴性结果，必须进行阴性对照实验。对照实验中任何荧光信号都应没有杂信号干扰。将单抗或基础抗体用水、PBS 或无关的同型抗体作为阴性对照。为排除干扰杂交或不同动物来源多克隆抗体的干扰，对照实验片应进行双重免疫表型实验。
4.在双重免疫表型实验中，与含有高浓度鼠免疫球蛋白的 20% 正常鼠血清孵育是成功进行第二次免疫表型的关键。兔抗鼠抗体的自由位点被封闭，不能与第二鼠抗人抗体（如 CD8) 结合。这次孵育后不需要洗片。双重免疫表型细胞进行 FISH 杂交，不使用生物素标记的抗体，因为它们会与第二单克隆鼠抗人抗体非特异性结合。
5.因为彩色荧光的限制，很难在一个实验中结合三种荧光颜色，如绿 FITC、红 Cy3、蓝 AMCA0 事实上，蓝色的 AMCA 荧光非常弱，而且不稳定，只能用在重复序列探针上。另一方面，FITC 比 Cy3 信号强度降低得快，而且与背景的对比度将降低。因此，我们建议使用 Cy3 交联抗体检测表达量低的抗原或位置小的特异性 DNA 探针。
6.我们没有发现分别变性和同时变性的细胞 DNA 和探针的结果有什么不同。许多实验室采用靶细胞 DNA 和探针 DNA 分别变性，随后 DNA 探针与人 Cot-1DNA 进行预复性。我们认为同时变性比较快速简便，结果与分别变性差不多。
7.在 FISH 研究中，我们发现在 0.IXSSC 中 60°C 进行 3 次杂交后洗脱，其洗脱效率与 42°C50% 甲酰胺/2XSSC 的差不多，而前者便宜、无毒。
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