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FISH 检测乳腺癌中 HER2 扩增实验

2019.9.10

试剂、试剂盒	胃蛋白酶中性福尔马林缓冲液甲酰胺乙醇
仪器、耗材	探针试剂盒荧光显微镜
实验步骤	一、切片及制片 1.从福尔马林固定石蜡包埋的组织块上切厚组织切片，37°C 水浴展片。 2.贴在正含电荷的载玻片上。 3.另连续切一张相应的组织切片，用苏木素和伊红（H&E) 染色（见注释 2)0 二、脱蜡和浸透组织切片 1.在 HE 切片上确认适当的肿瘤细胞位置（见注释 3)。 2.检查切片组织的成分及固定质量（见注释 4)。 3.烤箱或烤片器中烤片 60°C、2 h(见注释 5)。 4.将切片放入切片架，二甲苯 3 缸，每缸 5 min，去除石蜡。过 3 遍无水乙醇（见注释 6)。 5.用烤片器或电热板 45°C、3 min 干片。 6.将切片放入室温下 50 mL0.2mol/LHCl 中 20 min。 7.50 ml 蒸馏水洗片 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。 8.放入 81°C 的 lmol/LNaSCN 中，30 min(见注释 7)。 9.蒸馏水洗 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min(见注释 8)。 10.37°C 于胃蛋白酶溶液中 3?IOmin(见注释 4 关于最佳时间的说明）。 11.换新的 50 mL 蒸馏水洗 lmin，50 mL2XSSC 洗 2 次。 12.45°C、3 min 干片。 13.二次固定：室温下放至 10% 中性福尔马林缓冲液中，IOmin(见注释 9)。 14.2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。 15.45°C、3 min 干片（见注释]_0)。 16.放入 81°C 水浴中的 70% 甲酰胺/30%2XSSC 溶液中 5 min，使组织切片上的 DNA 变性。立刻连续放入 70%、85% 和 100% 乙醇中，每缸 Imin(见注释 11)。 17.45°C 不超过 2 min 干片。三、杂交 1.调暗室内灯光。 2.用微量加样器取 IOpL 探针溶液，呈线状滴加在盖玻片上（见注释 12)。 3.将盖玻片盖在组织上，橡皮泥暂时封片。 4.切片放入密闭湿盒（不能有水滴落），37°C、18 h(过夜)。四、杂交后洗脱 1.设置 71°C 水浴，加热 50 mL 含 0.3%NP-40 清洁剂的 2XSSC。 2.调暗灯光。 3.从温箱中取出载玻片，用镊子剥去橡皮泥，室温下将载玻片浸入 2XSSC/0.3%NP 中数分钟（见注释 13)。 4.将载玻片（一次不超过 4 张）放入加热（72°C) 的 2XSSC/0.3%NP 中 2 min。 5.取出载玻片，迅速放入室温的 2XSSC，空气干燥。 6.向盖玻片滴加 IOjuLDAPI，将载玻片盖在盖玻片上并翻转（见注释 14)。 7.用指甲油将盖玻片的边封上。 8.将玻片置于密闭的切片盒一 20°C 保存。 9.用显微镜观察前玻片恢复至室温并擦去多余的水分。五、分析 1.在明视野显微镜的低倍物镜（10X 或 4X) 下浏览 H&E 切片，找到想要研究的肿瘤细胞集中的区域（见注释 15)。 2.从不同视野中数 60 个肿瘤细胞（见注释 16)。 3.记下每个肿瘤细胞的红绿信号（见注释 17?20)。注释 1我们曾用 20 年的蜡块成功地进行了 FISH。 2.组织切片须由技术娴熟者用薄片切片机操作，始终保持切片方向一致。 3.此步应在病理医师指导下进行。应核对组织样本以确定包含适当的浸润性肿瘤细胞。只有浸润性乳腺癌细胞可以计数。浸润性肿瘤细胞必须与出现在同一切片上的导管原位癌细胞、淋巴细胞、组织细胞、间质纤维细胞或脂肪细胞区别开来。如果你的计数包括 2/2 计数细胞或扩增的细胞，应再次检查以确定在计数肿瘤细胞时没有将正常的组织细胞（尤其是渗出的淋巴细胞）计入。在低倍镜下扫描组织切片并标出肿瘤细胞区和标志物，有利于下一步定位 HSH 切片。标志物包括血管、脂肪组织区、正常导管区和 DCIS 区。分析 FISH 切片时要注意肿瘤内的异质性。注意任何不当的固定或组织变形（尤其当切片是冰冻切片时）都可能干扰判读。我们认为可以在 H&E 切片的盖玻片上用 Sharpie?marker 笔画出肿瘤区域以供参考。 4.蛋白酶处理的最佳时间取决于蜡块的年限，需要在进行 HSH 准备工作前了解组织成分和组织固定的质量。粗针穿刺的标本、含肿瘤细胞较少的切片和有大块坏死区域的组织要降低蛋白酶作用的时间。这些样本需要慎重对待以免过度消化。 5.同时，向染缸加入 50 mLlmol/LNaSCN 并放入水浴箱，将温度调至 81。。。 6.此步应在通风橱中进行。这些溶液可用于许多载玻片并使用几个月直至变脏才更换。 7.同时向染缸加入 50 mL0.2mol/L HCl 并放人 37°C 水浴，解冻一个包装的胃蛋白酶，于 O.2mol/L HC1 中混勻。准备下列物品备用：混合 35 mL 甲酰胺和 15 mL2XSSC，70%、85% 及 100% 乙醇各 50 mL。 8.取出切片后，关掉水浴，直到染缸内的 70% 甲酰胺、30%2XSSC 为 71℃。 9.从长期储存的蜡块制备的切片（手术后 2?3 年以上）如果未进行第二次福尔马林固定，信号会较明亮。 10.取出探针解冻，并确保 H&E 切片在旁边以供参考。 11.如果使用 HyBritechamber(VYSIS30-144010)，跳过 16 步和 17 步。 12.将盖玻片放在洁净的棕色纸巾上置于工作台.（醒目），手持载玻片，以组织切片的目标区域朝向探针，缓慢靠近直至接触到探针液体，迅速拿起并翻转载玻片，使盖玻片紧贴载玻片。探针溶液应在盖玻片下迅速扩散不形成气泡。用永久记号笔在载玻片上于盖玻片的上下角处画细线标记。 13.盖玻片应在液体中滑脱或用镊子轻柔地揭去。这时的组织非常脆弱要注意不能刮伤。 14.对较小的肿瘤细胞区域我们使用 5PL 探针及 18 mm 盖玻片。VWRScientific，目录号 48380046。 15.找到任一标记物，然后转到 25 倍物镜。用荧光显微镜在 H&E 切片上找到目标区域并注意这些标记物的位置，在荧光光源下的形态特征。带着这个印象再在 25 倍物镜下观察 FISH 切片，并找到细胞的位置。找到肿瘤细胞的区域并记住周围组织结构的特征。换 100倍物镜及油镜观察同一视野。肿瘤细胞中应不混有结缔组织，但仍像 H&E 切片所示成簇紧密排列。 16.用三色滤光片（橙/绿/DAPI 蓝）可以看到细胞核完全蓝染，探针呈明亮的橙色光点，而 CEP17 探针呈绿色光点。为确定杂交过程正确与否可用 2/2 计数分析一些间质细胞或邻近的淋巴细胞核。寻找不重叠而且信号明亮、分散的肿瘤细胞。寻找有两个绿色信号的细胞并计数相应的红色信号。 17.过度消化会导致肿瘤细胞离散或呈粗糙团块状，失去周围组织，如果出现这种情况，重复实验时要减少蛋白酶消化时间。固定过程不佳会导致「空心细胞」，组织结构虽然完整但是 DAPI 显色时会呈现黑色暗区。即使重复实验过程也不能弥补，只能仔细复习切片，在其他蜡块寻找保存最好的区域进行 FISH。估计载玻片制备的技术质量，并以此来评价样本是真正的单体性或多体性，还是应该重复实验。 18.通过单通道滤光片可以看见非常弱的信号，也就是用三色滤光片持续观察特定的细胞核，依次换黄色及绿色滤光片以确定在用三色滤光片下较弱的信号。 19.如果 HE 切片或 IHC 染色切片显示组织有异质性，从每个区域选取 20 个细胞进行进一步分析。我们及其他研究者（Ridofi 等）已发表文章说明 DCIS 和浸润性肿瘤成分的实验结果是不同的（图 1E)。 20.建议使用 Vysis 探针试剂盒收集每个细胞的红绿荧光信号信息。通过记录单个细胞可以评价异质性的程度和在样本中计数的分布。当所有数据以平均数形式给出时单个细胞的信息就不能体现。当评价低度或临界性扩增的病例时，这些信息就显得十分重要。展开

试剂、试剂盒

胃蛋白酶中性福尔马林缓冲液甲酰胺乙醇

仪器、耗材

探针试剂盒荧光显微镜

实验步骤

一、切片及制片

1.从福尔马林固定石蜡包埋的组织块上切厚组织切片，37°C 水浴展片。

2.贴在正含电荷的载玻片上。

3.另连续切一张相应的组织切片，用苏木素和伊红（H&E) 染色（见注释 2)0

二、脱蜡和浸透组织切片

1.在 HE 切片上确认适当的肿瘤细胞位置（见注释 3)。

2.检查切片组织的成分及固定质量（见注释 4)。

3.烤箱或烤片器中烤片 60°C、2 h(见注释 5)。

4.将切片放入切片架，二甲苯 3 缸，每缸 5 min，去除石蜡。过 3 遍无水乙醇（见注释 6)。

5.用烤片器或电热板 45°C、3 min 干片。

6.将切片放入室温下 50 mL0.2mol/LHCl 中 20 min。

7.50 ml 蒸馏水洗片 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。

8.放入 81°C 的 lmol/LNaSCN 中，30 min(见注释 7)。

9.蒸馏水洗 lmin，2XSSC 洗 2 次，每次 3 min(见注释 8)。

10.37°C 于胃蛋白酶溶液中 3?IOmin(见注释 4 关于最佳时间的说明）。

11.换新的 50 mL 蒸馏水洗 lmin，50 mL2XSSC 洗 2 次。

12.45°C、3 min 干片。

13.二次固定：室温下放至 10% 中性福尔马林缓冲液中，IOmin(见注释 9)。

14.2XSSC 洗 2 次，每次 3 min。

15.45°C、3 min 干片（见注释]_0)。

16.放入 81°C 水浴中的 70% 甲酰胺/30%2XSSC 溶液中 5 min，使组织切片上的 DNA 变性。立刻连续放入 70%、85% 和 100% 乙醇中，每缸 Imin(见注释 11)。

17.45°C 不超过 2 min 干片。

三、杂交

1.调暗室内灯光。

2.用微量加样器取 IOpL 探针溶液，呈线状滴加在盖玻片上（见注释 12)。

3.将盖玻片盖在组织上，橡皮泥暂时封片。

4.切片放入密闭湿盒（不能有水滴落），37°C、18 h(过夜)。

四、杂交后洗脱

1.设置 71°C 水浴，加热 50 mL 含 0.3%NP-40 清洁剂的 2XSSC。

2.调暗灯光。

3.从温箱中取出载玻片，用镊子剥去橡皮泥，室温下将载玻片浸入 2XSSC/0.3%NP 中数分钟（见注释 13)。

4.将载玻片（一次不超过 4 张）放入加热（72°C) 的 2XSSC/0.3%NP 中 2 min。

5.取出载玻片，迅速放入室温的 2XSSC，空气干燥。

6.向盖玻片滴加 IOjuLDAPI，将载玻片盖在盖玻片上并翻转（见注释 14)。

7.用指甲油将盖玻片的边封上。

8.将玻片置于密闭的切片盒一 20°C 保存。

9.用显微镜观察前玻片恢复至室温并擦去多余的水分。

五、分析

1.在明视野显微镜的低倍物镜（10X 或 4X) 下浏览 H&E 切片，找到想要研究的肿瘤细胞集中的区域（见注释 15)。

2.从不同视野中数 60 个肿瘤细胞（见注释 16)。

3.记下每个肿瘤细胞的红绿信号（见注释 17?20)。

注释

1我们曾用 20 年的蜡块成功地进行了 FISH。

2.组织切片须由技术娴熟者用薄片切片机操作，始终保持切片方向一致。

3.此步应在病理医师指导下进行。应核对组织样本以确定包含适当的浸润性肿瘤细胞。只有浸润性乳腺癌细胞可以计数。浸润性肿瘤细胞必须与出现在同一切片上的导管原位癌细胞、淋巴细胞、组织细胞、间质纤维细胞或脂肪细胞区别开来。如果你的计数包括 2/2 计数细胞或扩增的细胞，应再次检查以确定在计数肿瘤细胞时没有将正常的组织细胞（尤其是渗出的淋巴细胞）计入。

在低倍镜下扫描组织切片并标出肿瘤细胞区和标志物，有利于下一步定位 HSH 切片。标志物包括血管、脂肪组织区、正常导管区和 DCIS 区。分析 FISH 切片时要注意肿瘤内的异质性。注意任何不当的固定或组织变形（尤其当切片是冰冻切片时）都可能干扰判读。我们认为可以在 H&E 切片的盖玻片上用 Sharpie?marker 笔画出肿瘤区域以供参考。

4.蛋白酶处理的最佳时间取决于蜡块的年限，需要在进行 HSH 准备工作前了解组织成分和组织固定的质量。粗针穿刺的标本、含肿瘤细胞较少的切片和有大块坏死区域的组织要降低蛋白酶作用的时间。这些样本需要慎重对待以免过度消化。

5.同时，向染缸加入 50 mLlmol/LNaSCN 并放入水浴箱，将温度调至 81。。。

6.此步应在通风橱中进行。这些溶液可用于许多载玻片并使用几个月直至变脏才更换。

7.同时向染缸加入 50 mL0.2mol/L HCl 并放人 37°C 水浴，解冻一个包装的胃蛋白酶，于 O.2mol/L HC1 中混勻。准备下列物品备用：混合 35 mL 甲酰胺和 15 mL2XSSC，70%、85% 及 100% 乙醇各 50 mL。

8.取出切片后，关掉水浴，直到染缸内的 70% 甲酰胺、30%2XSSC 为 71℃。

9.从长期储存的蜡块制备的切片（手术后 2?3 年以上）如果未进行第二次福尔马林固定，信号会较明亮。

10.取出探针解冻，并确保 H&E 切片在旁边以供参考。

11.如果使用 HyBritechamber(VYSIS30-144010)，跳过 16 步和 17 步。

12.将盖玻片放在洁净的棕色纸巾上置于工作台.（醒目），手持载玻片，以组织切片的目标区域朝向探针，缓慢靠近直至接触到探针液体，迅速拿起并翻转载玻片，使盖玻片紧贴载玻片。探针溶液应在盖玻片下迅速扩散不形成气泡。用永久记号笔在载玻片上于盖玻片的上下角处画细线标记。

13.盖玻片应在液体中滑脱或用镊子轻柔地揭去。这时的组织非常脆弱要注意不能刮伤。

14.对较小的肿瘤细胞区域我们使用 5PL 探针及 18 mm 盖玻片。VWRScientific，目录号 48380046。

15.找到任一标记物，然后转到 25 倍物镜。用荧光显微镜在 H&E 切片上找到目标区域并注意这些标记物的位置，在荧光光源下的形态特征。带着这个印象再在 25 倍物镜下观察 FISH 切片，并找到细胞的位置。找到肿瘤细胞的区域并记住周围组织结构的特征。换 100倍物镜及油镜观察同一视野。肿瘤细胞中应不混有结缔组织，但仍像 H&E 切片所示成簇紧密排列。

16.用三色滤光片（橙/绿/DAPI 蓝）可以看到细胞核完全蓝染，探针呈明亮的橙色光点，而 CEP17 探针呈绿色光点。为确定杂交过程正确与否可用 2/2 计数分析一些间质细胞或邻近的淋巴细胞核。寻找不重叠而且信号明亮、分散的肿瘤细胞。寻找有两个绿色信号的细胞并计数相应的红色信号。

17.过度消化会导致肿瘤细胞离散或呈粗糙团块状，失去周围组织，如果出现这种情况，重复实验时要减少蛋白酶消化时间。固定过程不佳会导致「空心细胞」，组织结构虽然完整但是 DAPI 显色时会呈现黑色暗区。即使重复实验过程也不能弥补，只能仔细复习切片，在其他蜡块寻找保存最好的区域进行 FISH。

估计载玻片制备的技术质量，并以此来评价样本是真正的单体性或多体性，还是应该重复实验。

18.通过单通道滤光片可以看见非常弱的信号，也就是用三色滤光片持续观察特定的细胞核，依次换黄色及绿色滤光片以确定在用三色滤光片下较弱的信号。

19.如果 HE 切片或 IHC 染色切片显示组织有异质性，从每个区域选取 20 个细胞进行进一步分析。我们及其他研究者（Ridofi 等）已发表文章说明 DCIS 和浸润性肿瘤成分的实验结果是不同的（图 1E)。

20.建议使用 Vysis 探针试剂盒收集每个细胞的红绿荧光信号信息。通过记录单个细胞可以评价异质性的程度和在样本中计数的分布。当所有数据以平均数形式给出时单个细胞的信息就不能体现。当评价低度或临界性扩增的病例时，这些信息就显得十分重要。

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乳腺癌 fish

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