RNAi技术研究进展
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是多种生物体内由双链RNA(doublestranded
RNA，dsRNA)介导同源mRNA
降解的现象。RNAi现象先后在不同生物中被发现，植物学家称它为共抑制(co-suppression)或转录后基因沉默(post
transcriptional gene
silencing，PTGS)；线虫和果蝇的研究人员称它为RNAi；真菌的研究者称它为消除作用(quelling)。现在人们己经意识到RNAi现象在生物体中普遍存在，而且可能有着共同的生物学意义和相似的作用机制。
1、RNAi的发现与发展
1990年，在转基因植物牵牛花(
Petunias)的研究中发现，将色素合成基因置于一个强启动子后，导入牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果是不仅转入的基因未表达，而且自身色素合成也减弱了。当时将这种现象称为PTGS或“共抑制”(cosuppression)。Ramamor
N等在粗糙脉孢菌中导入合成胡萝卜素基因后，约30%的被转化细胞中自身合成胡萝卜素的基因失活，他们称为基因静止(quelling)。康乃尔大学的Guo
S 等用反义RNA 技术阻断秀丽新小杆线虫中parl 基因的表达时，发现正义RNA 和反义RNA
均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制各异。华盛顿卡耐基研究院的Fire A
等首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默，并将这一现象称为RNA干扰，于2006年荣获诺贝尔生理医学奖。在1999年短短的一年间，发现RNAi
现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNAi现象。
2、RNAi的作用机制
Hamilton等和Ketting等分别在发生共抑制的烟草和西红柿中鉴定了一些大约25 个碱基大小的与沉默基因的正义链和反义链互补的RNA。Zamore 等在果蝇细胞中发现被注射进入的双链RNA被切割为21～23 碱基长短的双链RNA片段。他们认为这些siRNA 在RNAi 过程中起着重要作用。这些siRNA一般为长21～23 个碱基对的双链 3’端具有2个突出的碱基，多为尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羟基；5’端被磷酸化。这些特点可能是其与别的RNA 相区别，能被特异地识别，而这一特点也是RNase III 酶切后的特征。研究表明mRNA 被特异性切割发生在细胞质中当双链RNA 进入细胞后，能与类似RNase III 的Dicer 结合，随即被切割成21～23个碱基的siRNA。siRNA与RISC( RNA induced silencing complex) 结合，若双链5’端未被磷酸化，则会启动其磷酸激酶活性，将其磷酸化并被解螺旋。反义链RNA 与RISC 结合后将其内切酶活性激活，激活的RISC 在细胞质中寻找能与反义RNA 同源的mRNA，并在双链的中心部位、距双链RNA 5’端第10 个碱基处将其切割，从而使mRNA 降解。Sijen等认为双链RNA 在RNAi 初期的作用是为RdRP ( RNAdependent RNA Polymerase ) 提供引物，并以靶mRNA 为模板合成更多的双链RNA。这一假设在其它物种中得到证实。
目前人们已经在线虫、果蝇、拟南芥及脉胞菌等物种中鉴定了多个与RNAi 过程相关的基因，如线虫基因ego - 1，rde - 1和rde
- 4，脉胞菌的qde -2，拟南芥的ago1基因等。RNAi
在生物体的进化与发育过程中具有相当的保守性。AGO1，QDE2和RDE1在植物的转基因沉默、真菌的压抑现象和动物的RNAi中起着相似的作用。Boutla等从产生基因沉默的植物中提取RNA，在注射到线虫后引起了特异基因的沉默。但不同物种间在RNAi
上仍有较大的差异。在哺乳动物细胞中用21个碱基对的双链RNA 可以引起特异的抑制反应，而较长的双链RNA (超过30个碱基对)
转染哺乳动物细胞会引起非特异的基因抑制。长的双链RNA
激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化使翻译起始因子eIFa失活，导致翻译抑制或者长dsRNAs激活RNase
L，导致非特异的RNA 降解。
3、RNAi技术
进行RNAi首先要进行的是目的基因的选择，在目前所进行的实验中一般选择对应于能被容易检测的表型的目的序列。自从发现使用cDNA模板RNAi突变拟表型的外显率比使用基因组模板高后，cDNA序列成为指定的模板。然而，在没有cDNA的情况下，也可以使用富含外显子的基因组序列。RNAi效率可能受所用dsRNA长度和结构类似物等其他因素的影响。传递dsRNA的方法也可能影响RNAi反应的强度。在C.elegan中传递RNA最普遍的方法是对微生物多核体、体腔或内脏进行微注射。在C.elegan中对成年蠕虫进行微注射被认为是最有效的RNAi途径。虽然其他传递RNA的方法强度较小，但是dsRNA浸泡、给蠕虫喂养表明C.elegan
dsRNA的E.coli方法已经被用来进行整个基因组功能分析和高通量筛选。
4、RNAi的应用
4.1 研究功能基因组
虽然RNAi的作用机制还有很多未搞清楚，但是有很多的分子生物学家认为RNAi 是研究功能基因组的一个非常有用的工具。因为RNAi已被用来研究并搞清楚了包括果蝇、线虫和一些植物的基因的功能。最近研究者甚至找到了更便利的方法，即通过增强内源的RNA 发夹状结构的表达，诱导稳定的具有序列特异性的的沉默现象，从而可以建立持续缺失某种功能表型的细胞系，为生化分析提供大量的沉默细胞，同时，对某种表型进行长时间的观察评价也成为可能。预计不久的将来，很多类型的培养细胞都能生长在“RNAi 芯片”——siRNA 的点阵的上面，可以记录基因组中每个基因被抑制表达以后的表型，以及多个基因被渐次抑制后的综合表型，从而可以知晓基因的功能及他们之间的相互作用。总之，RNAi 将在后基因组时代为解决疾病机理和鉴定候选药物靶向的关键问题——基因功能鉴定中发挥其简捷高效的特点而为人类服务。
4.2 在发育生物学以及核移植中的应用
为了研究胚胎在早期发育过程中的事件，通常人们想的是去除特定基因的表达，如果能在特定的时间里把胚胎细胞中的人们感兴趣的基因的功能去除后人们将会得到很有价值的信息。
当Dicer的同系物SIN1/ CARPEL FACTORY 发生突变时，动物个体将发生严重的发育缺陷，表明RNAi 路径在某种意义上能够调控与发育有关的基因的表达。最近的资料表明，在生产单短暂RNA(single temporary RNA，stRNA)时需要Dicer，stRNA 可以抑制靶mRNA 的翻译，同时包含PAZ和PIPW结构域的PPD 蛋白在干细胞、卵子发生、组织分化发育中都起着重要的作用。以上资料表明，Dicer及其同系物在动物的发育过程中确实比较关键。一个受精卵或动物的体细胞中具有相同的基因信息，所以能分化成各种不同类型的细胞，是由于不同基因表达的结果。
实验表明，Dicer 这个基因组的支配者和护卫者，存在于哺乳动物的细胞质中，核移植生产克隆动物要移去一部分的细胞质，也就是说要移去一部分的Dicer和mRNA，那么这个步骤是否影响供体核的基因的重编程，Dicer在体细胞克隆动物的最初发育调控过渡：由体细胞核的转录后沉默到合子核转录活性的出现这一过程中，究竟起着怎样的作用尚待研究。另外RNAi 作用中的组成成分和印记基因，以及X 染色体失活的关系如何，都是非常吸引人的研究课题。
4.3基因治疗
RNAi的靶位识别是一个有着高度序列特异性的过程。由siRNA 到靶链，互补的靶位识别具有专一性，3′端突出中的倒数第二个核苷酸影响靶mRNA 的裂解，一旦错配，将会使RNAi 的作用降低2～4 倍，指导性siRNA 的5′端和3′相对而言，对错配也有一定的允许性，但是与靶RNA 的断裂位点相对的siRNA 中央的核苷酸是决定特异性非常重要的因素，即便有一个核苷酸改变，实验过程中就不能检测到RNAi 现象，说明siRNA 双链能够辨别基因靶位时的突变或多态性等位基因(polymorphic alleles)，对将来的治疗发展非常有利。现在还不知道以RNAi 机制抵抗病毒或者动物病毒基因编码的蛋白对RNAi 是否起抑制作用，但了解RNAi 系统的作用机制，以及其与动物病毒的相互作用是建立以RNAi为基础的人类疾病基因治疗中的重要一环。
RNAi 技术的研究成果已经在整个研究领域引起了巨大反响，由于能够快速而简便的制备某个基因的功能缺失表型，它已成为基因功能研究中最有效的工具。在以后的研究中可以构建带有特异性启动子或与可诱导系统结合的siRNA 表达载体，使得RNAi有选择的出现在发育的不同时期或不同器官中。将RNAi 同芯片(chip)、单核苷酸多肽性(SNP) 等技术的结合，必将推动了RNAi 技术在应用领域的研究进展。
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