案例解析 | 抗病毒生物大分子制药治疗（二）
No.2基于转基因牛的抗病毒血清研究
在抗击SARS和流感的临床疗法中，“恢复期血浆”治疗(Convalescent‑phase plasma therapy)获得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，该法的疗效很大程度上依赖于是否能及时获得有效的血清。相比下，基于动物的超免疫血清虽然能解决量的问题，但其使用可能会导致严重的免疫反应和毒性。单克隆抗体疗法，又一种基于被动免疫的治疗方法，面临耗时长和出现耐药突变病毒株等挑战。
为了解决上述的问题，有研究人员将目光转向了转基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)来快速获得大量、有效的抗病毒血清。通过基因工程，研究人员敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亚型人抗体表达体系，来达到免疫系统人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高达150到600 g的人IgG。目前，已有多项临床前研究利用该技术对抗MERS和Ebola等传染病[3,4]。在此，我们着重介绍靶向MERS的研究。
在免疫原段，该研究利用了两种材料：灭活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的纳米材料(SPNV)。两种免疫原均能刺激产生S蛋白特异的血清和人IgG(SAB-300/301)。基于安全性和生产可行性等因素，研究主要围绕基于SPNV产生的人IgG开展动物和临床研究。
上图：基于转基因牛的免疫过程。下图：利用Anti-Spike抗体检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）的有效含量。图片源自参考资料3。
除了特异性检测外，研究利用免疫荧光成像技术，结合Anti-Spike抗体来衡量免疫所得血清和抗体的抗病毒中和作用(FRNA50)。相较于只能完成一轮感染的假病毒体系，FRNA50能直观、全面地反映药物处理对于病毒感染能力的影响。在该研究中，此法还结合mRNA检测验证病毒的灭活效果，确保疫苗的安全性。结合FRNA50和传统的半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)测定法，研究证明纯化的血清含有高水平的中和多抗。在过表达DPP4的小鼠模型上，无论是预防性还是治疗性给药，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已进入一期临床试验。
利用FRNA50检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高内涵平台和配套微孔板。图片源自参考资料3。
No.3利用ADCC抗击H7N9禽流感的单抗研究
作为肿瘤免疫疗法的主要推动者，单克隆抗体（单抗）也被广泛用于抗击SARS和HIV等多种病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和单抗的研究也为疫苗设计提供了新的思路。但是，基于杂交瘤技术的传统单抗制备面临着耗时长，步骤多且繁琐等问题，限制了其对可能出现的新型疫情爆发的应对能力。相比下，噬菌体展示技术为快读获得高亲和力人源单抗提供了新的途径。基于该技术平台，复旦大学研究人员建立超大型天然全人源抗体库，并成功鉴定靶向MERS和流感的强力抗体[5,6]。
在抗击H7N9流感的工作中，为了获得低突变的高特异抗体，研究人员以重组表达的HA和HA1蛋白为抗原，基于健康人B细胞来源的天然抗体库开展多轮筛选，获得单抗m826。经序列分析，研究人员证明m826与胚系基因高度同源，是胚系抗体。相较于体细胞高度突变的抗体，胚系抗体建立时间短，安全性高且成药性更好，适用于靶向急性感染的抗体和疫苗研发。
基于噬菌体展示技术的H7N9抗体筛选，图片源自参考资料6。
非常有意思的是，在红细胞凝集抑制 (Hemagglutination inhibition,HI)反应中，m826仅表现出微弱的抗病毒能力。进一步的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)检测和免疫荧光法中和实验证明m826不能中和流感病毒，抑制其在靶细胞的增殖。利用亲脂性荧光染料R18和SP-DiOC18（3）来标记病毒，研究发现m826对病毒与靶细胞的结合和膜融合过程无显著影响。但是，m826能很强结合表达H7N9 HA蛋白的细胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）活力的强力介导者。同时，由于不能中和H7N9病毒，m826还能成为高价值的工具性抗体。在动物模型上，IgG1 m826能有效的预防和控制H7N9的感染。因此，m826依赖于ADCC，而不是中和能力抗击流感病毒。这一发现为抗病毒抗体的筛选和研发提供了新的思路和途径。
左图：基于免疫荧光成像技术（荧光标记病毒）的中和实验，H7N4抗体为中和阳性对照。右上：病毒结合检测，红色荧光探针R18标记病毒，感染30分钟后进行成像检测。NA为结合阴性对照；m336为阴性对照抗体。右下：利用荧光探针R18和SP-DiOC18（3）双标记病毒，病毒膜融合发生会诱导SP-DiOC18（3）绿色荧光信号加强。Baf A1为融合阴性对照。上述高通量成像检测均基于Opera或Operetta高内涵平台。图片源自参考资料6。
