案例解析 | 抗病毒生物大分子制药治疗（三）
No.4靶向膜融合的广谱抗病毒多肽研究
作为动物来源的病毒，冠状病毒因其多样性，较高的传播能力和进化能力限制了单一的靶向疗法的临床应用。因此，从长远角度来看，能作用于多种冠状病毒的新型广谱抗病毒药物，会成为抗击流行性和新型冠状病毒感染的终极武器。相较于高度变异的受体结合区(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)区高度保守。同时膜融合也是病毒感染和复制重要的功能性过程。因此，该区域成为了抑制性多肽的研究重点。靶向冠状病毒的膜融合过程，来自于复旦大学的研究团队研发出广谱多肽抑制剂EK1，为抗击冠状病毒和类似病毒提供了新的大分子治疗策略[7]。
冠状病毒可通过胞内体膜融合途径(Endosomal pathway)或/和细胞表面胞浆膜融合途径(Non-endosomal pathway)进入细胞。病毒通过结合宿主细胞受体激活其S2亚基的HR1和HR2区，互相结合形成对膜融合至关重要的6-HB(Six-helix bundle)结构。
冠状病毒的膜融合过程和竞争性多肽工作机制，图片源自参考资料7。
鉴于此，研究人员以多种冠状病毒的保守HR区为模板，合成HR1和HR2区来源的多肽（HR1P和HR2P）用于竞争。通过过表达技术，研究进一步建立靶向多种冠状病毒的细胞细胞融合实验，系统性筛查HR1P和HR2P对细胞融合的抑制。结果显示由OC43株来源的HR2P具有广谱且强效的抑制融合能力。在此基础上，研究人员通过引入氨基酸和突变等方法，进一步优化多肽的可溶性和成药性。所获得的多肽EK1，在进一步的一系列体外检测，包括细胞细胞融合实验，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力检测中，都表现出强效的广谱抗病毒能力。
细胞细胞融合实验，过表达病毒S蛋白并带有GFP信号的293T细胞为作用细胞，Huh-7为靶细胞，图片源自参考资料7。
除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽类药物的另一优势是支持非侵入性鼻腔给药，适合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，检测鼻腔给药下的EK1的体内分布非常重要。基于活体成像技术，研究观察到Cy5荧光标记的EK1可广泛分布于整个呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝脏、肾和脾，都能检测到EK1的分布，表明EK1可以进入血液循环系统和其他脏器中。因此，EK1还可能作用于由冠状病毒导致的系统性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表现出强力的抗病毒能力，有效抑制了因感染带来的体重减轻和死亡现象。从体外到体内的多方面安全性评价表明通过鼻腔给药的EK1是低免疫原性，安全的治疗策略。因此，EK1是一个新型、有潜力的广谱抗冠状病毒药物，值得进一步的深入研究。
上：基于活体成像检测鼻腔给药下Cy5标记的EK1在小鼠体内的分布；小动物活体成像检测基于IVIS平台。下：EK1处理对模型鼠死亡率、体重和病毒滴度的影响，图片源自参考资料7。
总结
通过上述四个案例，我们总体介绍了靶向病毒段的大分子疗法的研究流程和关注点。助力此类治疗方法的研发，珀金埃尔默提供成熟的整体应用解决方案。针对携带萤火虫报告基因的假病毒研究，我们提供全面、配套的涵盖化学发光试剂，微孔板和高通量检测平台的解决方案。对于基于慢病毒包装系统的假病毒，我们还可以提供p24检测解决方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平台的解决方案，我们还可以分析短程和长程的复杂亚细胞活动，例如由病毒介导的膜融合过程。在血清和抗体的筛查和分析中，强大的高内涵解决方案能最大程度发挥表型筛选的优势，发现具有中和能力、安全的潜在抗体。同时，ADCC，作为关键的抗感染抗体工作机制之一，也是我们的主要应用关注点。针对ADCC的检测，我们提供金标准、灵活的放射和非放射解决方案，助力抗体类药物的深入评价[8]。最后，在临床前动物研究中，除了中和检测外，我们提供覆盖功能到结构的活体成像解决方案，助力病理检测、药物分析和药效评价等核心工作。
参考文献
1. 药物机制解读 | “人民的希望”抗病毒药物瑞德西韦(Remdesivir)https://mp.weixin.qq.com/s/MyJO1XjkD6uQAgsoMFTxEw
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3. Luke T, et al. Human polyclonal immunoglobulin G from transchromosomic bovines inhibits MERS-CoV in vivo. Sci Transl Med. 2016 Feb 17;8（326）:326ra21.
4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218（Suppl 5）: S636–S648.
5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.
6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22（4）: 471–483.e5.
7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5（4）: eaav4580
8. DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ
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