高效液相色谱法(二) 枸橼酸离子
照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验
采用十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱,柱长250mm,柱直径4.6mm,粒度5μm。流动相为18.2mmol/L磷酸盐缓冲液,0.1%异丙醇溶液(pH 2.0～2.5);柱温40℃;流速为每分钟1.0ml;样品池温度为室温;运行时间50分钟;紫外检测器检测波长为210nm。取5.0mmol/L枸橼酸离子溶液20μl,注入色谱柱,记录色谱图,拖尾因子按枸橼酸离子色谱峰测定应为0.95～1.40。
测定法
精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)0.735g,置100ml量瓶中,用超纯水溶解并稀释至刻度。精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml,分别置25ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得相应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图;另精密量取供试品溶液1ml,置15ml离心管中,精密加1.5%磺基水杨酸4ml,混匀,室温静置2小时以上,以每分钟3000转离心10分钟,取上清液,同法测定。
以对照品溶液的枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归,求得直线回归方程。计算供试品溶液枸橼酸离子含量(mmol/L),再乘以相应的供试品稀释倍数(5),即为供试品枸橼酸离子含量(mmol/L)。
【附注】(1)根据供试品枸橼酸离子含量,可适当调整枸橼酸离子对照品溶液浓度。
(2)根据供试品蛋白质浓度,可适当调整沉淀剂磺基水杨酸的加入量。
(3)直线回归相关系数应不低于0.999。
推荐
