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液相色谱仪液体样品预处理技术--样品预处理技术概述

2022.2.01

色谱分析的全过程主要包括四个步骤:样品的采集、样品的制备、色谱分析及数据处理与结果的表达。样品采集包括取样点的选择和样品的收集、样品的运输和储存;样品制备包括将样品中欲测组分与样品基体和干扰组分分离、富集及转化成色谱仪器可分析的形态等操作。色谱分析样品的采集和制备是一个非常重要且复杂的过程,通常将色谱样品的采集和样品的制备统称为色谱分析样品预处理技术。

样品预处理作为色谱分析的重要步骤,建立简单、快速、有效的样品预处理方式以使复杂样品的色谱分析获得较低的检测背景,同时能获得较高灵敏度是色谱分析工作者一直都在追求的目标。由于色谱分析技术涉及样品的种类繁多、组成及其浓度复杂多变、物理形态范围广泛,直接进行分析测定构成的干扰因素特别多,通常需要对样品做一些必要的预处理。

现代色谱仪器对样品分析所用的时间越来越短,但是样品的制备过程所用时间却仍然很长。统计表明,大部分色谱分析实验室中用于色谱分析样品制备过程的时间约占整个分析时间的2/3,而只有10%的时间用于色谱分析,其余时间用于分析测定结果的整理和输出报告等。对提高工作效率而言,改善和优化色谱分析样品制备的方法和技术是一个重要环节。

液相色谱对样品的要求是液体或者是可溶解在某些溶剂中的固体,通常是不挥发或难挥发的样品,而且其中不能含有微小的颗粒物以免色谱柱发生堵塞。此外,在使用色谱技术进行样品分析时,常常会遇到采集的原始样品不适合于直接进行色谱分析的要求,样品中目标组分的含量很低,特别是原始样品基体干扰大的情况,诸如样品是黏滞的流体、胶体溶液或者固体等,这使得色谱分析的样品制备方法及其技术在现代色谱分析中越来越重要。

迄今为止,除用于已知样品组成与测定范围的流程色谱仪外,色谱仪器还不能做到在现场环境直接收集样品并自动完成样品的选择、分离和测定等步骤,一般需要离线进行样品的采集和处理。

因而,样品预处理要比HPLC分离与数据分析花费更多的时间样品预处理可能是HPLC方法建立中最具挑战性的一个环节。样品预处理开始于样品的采集,一直到样品注入HPLC、上柱,其中包括多步操作,见表1的总结。HPLC分析的精密性与准确度往往决定于样品的预处理步骤,可见,必须认真对待、仔细设计样品的预处理过程。表2也依据样品的形态对样品的预处理方法进行了系统的分类。

表1 样品预处理的选择

选择	评述
(1)样品的收集	用符合统计学的程序获得有代表性的样品
(2)样品的储藏与保存	用适的惰性、密封容器;特别小心易挥发、不稳定或活性的物质;如必要,稳定样品;生物样品可能需要冷冻
(3)样品的初加工	样品形式必须适于有效的样品预处理(如干燥、过筛、碾细等);细小的离散样品易于溶解或提取
(4)称重或定容稀释	有必要注意活活性,不稳定或生物物质;稀释时,用经校正的容量器皿
(5)其他的样品加工方法	溶剂替换、除盐、蒸发、冷冻干燥等
(6)除去微粒	滤过、固相萃取、离心
(7)样品的提取	液体样品方法,固体样品方法
(8)衍生化	主要用于增强被测物的检测精度;有时也用于改善分离

表2 样品预处理方法

样品类型	样品预处理的方法	技术原理	评述
液体	固相萃取	液体流过能选择性地捕集被测物(或干扰物)的固定相;捕集的被测物可用强溶剂洗脱下来;有时,保留干扰物而允许被测物通过固定相,不被保留;机制同HPLC	用于选择性捕集所需无机、有机和生被测物的固定相有很多种;也有用于药物、烃类、儿茶酚胺和许多其他种类的化合物、痕量水富集的特殊固定相
液-液萃取	样品在两种不混溶的液相中分配,应选溶解性差异较大的液相	注意勿形成乳液—加热、加盐可使之坏;用不同溶剂或影响化学平衡的添加剂(如缓冲剂调节pH值、盐改变离子强度试剂、离子对试剂等)改变K_D值;有许多连续提取低K_D或大体积样品的报道
稀释	用与HPLC流动相相溶的溶剂稀释样品,避免色谱柱超载,或使其浓度在检测器线性范围内	为避免谱峰扩展,溶剂应于HPLC流动相中混溶;“稀释即可进样”是简单的液体样品如药物制剂的一般样品制备方法
蒸发	在大气压下缓缓加热除去液体,可通过气流、惰性气体或真空辅助操作进行	蒸发勿过快;暴沸会损失样品;注意样品在容器壁上的损失;勿过热蒸干;在惰性气体下蒸发较好,如N₂;最好使用旋转蒸发器;已有自动系统(如Turbovap)可用
蒸馏	加热样品至溶剂的沸点,挥发性被测物在蒸气相中浓缩、冷凝和收集	主要用于易挥发的样品;如加热温度太高,样品会分解;低蒸气压化合物可用真空蒸馏;蒸汽蒸馏最高温度为100℃,相当温和
微渗析	在两种水溶液之间置一片半透膜,样品溶质依其浓度差,从一溶液转移至另一溶液中	渗析物需用富集技术浓缩,如SPE;微渗析用于检测活性动植物组织和发酵液中细胞外的化学物质;已与微LC柱在线联用;由于高分子量蛋白不能通过滤膜,用分子量截止膜的渗析也能在线用于HPLC样品的脱蛋白;同样可用超滤与反渗析法
冷冻干燥	冷冻水溶液样品,真空下水分被升华除去	有利于非挥发性有机物;可处理大体积样品;可能损失挥发性被测物;能浓缩无机物
混悬液	过滤	液体通过滤纸或滤膜,滤除悬浮颗粒	极力推荐该法以排除反压问题,延长色谱柱寿命;滤膜必须与溶剂相兼容,使其在实验中不致溶解:大孔径(>2μm)滤器可提高流速,小孔径滤器(<0.2μm)可除去细菌
离心	样品放于锥形离心管中,以高速旋转;倾出上清液	有时从离心管中取出定量固体样品较沉降难;超速离心一般不用于去除简单微粒
沉降	在沉降容器中静止放置,使样品沉淀;沉降速率取决于Stoke半径	为一极慢过程;依照沉淀速率,可在不同水平下人工回收不同粒径的微粒
固体	固-液萃取	样品置于具塞容器内,加入溶剂溶解被测物;从固体中滤出溶液(有时亦称“振摇/过滤”法)	有时可煮沸或回流溶剂以提高溶解度;细小分散状态的样品易于浸出;样品可用人工或自动振摇;经过滤、倾析或离心等操作,从不溶性固体中分离出样品
索氏提取	样品可用样品置于活动的多孔容器(套管)中;回流溶剂连续流过该套管,溶解被测物,连续收集到蒸馏瓶中	以纯溶剂提取;样品在溶剂的沸点处必须稳定;缓慢,但提取直至完成不需有人照看;价低对自由流动粉末最好;回收率很好(可用于其他固相萃取法的参照标准)
强制流动浸出	样品置于流通管中,并使溶剂从中流过;加热流通管至溶剂的沸点附近	适于颗粒性样品;溶剂能用高压N₂注入或推过;所需溶剂体积小于索氏提取;结果相似,速度更快
均匀化	样品置于混合器中,加入溶剂,使样品均一化成细小离散状态;除去溶剂,进一步混匀	用于动植物组织、食品、环保样品;可用有机及水溶剂;可加于冰或硅藻土增大样品的流动性;对小分散样品的萃取效率较高
超声	细小的分散样品浸没于装有溶剂的超声容器中,进行超声辐射。也可用超声探头或杯型超声破碎器进行操作	用超声作用辅助溶解;可加热提高萃取速率;安全、快速;最适于粗糙、颗粒状物质;可同时处理多份样品;与溶剂的接触效率高
溶解	用强溶剂直接溶解试样,使被测物溶入溶液,避免发生化学反应	无机固体可能需加酸或碱达到完全溶解;有机样品往往能直接溶于溶剂中;溶解后,可能需要过滤
加速溶剂萃取(ASE)	样品置于密封容器中,加热至沸点以上,使容器中的压力上升;自动取出萃取样品,并转移至小瓶中作进一步处理	可大大加快液-固萃取过程;自动化;容器必须能耐高压;萃取的样品较稀,需进一步浓缩;由于使用高压、高温溶剂,需有安全措施
自动索氏提取	热溶剂浸出与索氏提取的结合;套管中的样品先浸没在沸腾溶剂中,然后升温,进行常规索氏提取/用回流溶剂淋洗,最后浓缩	人工与自动操作均可;所需溶剂量少于传统索氏法;溶剂可回收利用;由于二步操作,可减少提取时间
超临界流体提取	样品置于流通容器中,超临界流体(如CO₂)流过样品;降低压力后,提取的样品收集在溶剂中或捕集到吸附剂上,然后再以溶剂淋洗解吸附	人工与自动操作均可;可采用改变超临界流体密度或加入改性剂的方法,改变超临界流体的极性;收集的样品通常较浓因为CO₂在提取结束后即被除去,因此相对无污染;基质影响提取过程;方法建立的时间可能比其他现代方法长
微波辅助提取	样品置于开口或密闭的容器中,以微波能量加热,使被测物被提取到溶剂中	提取溶剂可分为吸收微波溶剂(MA)和不吸收微波溶剂(NMA)两种;采用MA样品置于高压容器中,如加速溶剂萃取(ASE),充分加热至沸点以上;采用NMA时,容器可开口操作,无压力升高现象;微波箱中用有机溶剂(MA或NMA)与MA在高压操作时,需有安全操作规程
热提取	采用动力学顶空进样形式,但加热提取加热样品至很高(可控制)的温度,可高达350℃	系统必须由熔融石英或熔融硅胶制造,使提取的被测物不至于与热金属表面发生反应;应避免系统局部过冷;适用于蒸气压较低的样品