GFP 和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用实验 2
16. 标记反应以后，采用下述公式计算标记率：
Aλ X M / [ ( A280-ƒ X Aλ ) X ελ ]
式中 Aλ是染料在其最大吸收波长λ处的吸收度，A280 是蛋白质在 280nm 的吸收度，M 是以 kDa 为单位的蛋白质分子质量，ελ是染料在波长 λ 处的摩尔消光系数，以 L•mmol-1•cm-1 为单位。公式以染料在 280nm 处的吸收进行校正。系数ƒ是染料在 280nm 和最大可见吸收波校λ的吸收度比值。例如，Cy3 标记抗体的标记率公式就变为：
A554 X 170 / [ ( A280 - 0.05 X A554 ) X 150 ]
为了验证染料的结合是否会影响 Fab, 整个抗体或者蛋白质的生理功能，将标记产物与相应的未标记成分进行持异性活性比较。特异性活性包括催化活性或蛋白质结合活性。这些蛋白质结合分析可以采用琼脂糖固定的肽配体或磷酸酪氨酸颗粒来进行。这种结合活性测试的标准探作规程可以参阅《抗体技术实验指南 (Using Antibodies)》（Harlow and Lane1999)。(该书中译版已由科学出版社 2002 年 9 月出版。------编者注）
第二阶段 FLIM.FRET 分析的细胞制备
材料
缓冲液和溶液
将贮存溶液稀释到适当的浓度。
明胶溶液（0.1%)
可选，请参见第 1 步。
将 0.5 g 明胶（Porcine,Sigma) 溶于 500 ml 1X 麻酸盐缓冲液液中。高压灭菌。
磷酸盐缓冲溶液（PBS)
聚-L-赖氨酸
可选，请参见第 1 步。
可以从 Sigma 购得 0.1%(m/V) 水溶液，使用前用水按 1:10 稀释。
核酸和寡核苷酸
载有探针的质粒 DNA
编码了目标蛋白质的 GFP 融合载体（CLONTECH)。
培养基
CO2-非依赖性成像培养基
这种低背景的荧光培养基可以从 Life Technologies 购得，或者采用经 Dulbecco 修改 Esgle's 的培养基的标准组成中除去下列成分以后的培养基：pH 标记物酚红、青霉素、链霉素、叶酸以及维生素 B2。使用前采用以 NaOH 调至 pH7.4 的无菌 HEPES(终浓度为 50 mmol/L) 来补充培养基。
成像培养綦必须不含有自动荧光成分。
专用装置
组织培养板（6 孔或 12 孔）（Nunc), 或者
玻璃底组织培养皿（35 mm,MatTek Corporation)，或者
腔室载玻片或腔室盖破片（Labtek,Nunc)。
附加试剂
本方案中的第 2 步需要用第 16 章中介绍的转染方法所需的试剂。
细胞和组织
进行转染的细胞株（贴壁或悬浮培养）
除了考虑细胞株是否适合所研究的系统以外，选择细胞类型惟一需要考虑的就是通过—些方法可以方便地将它们固定（请参见第 1 步说明）。
方法
1. 将细胞移植到适当的表面进行显微观察：
对于活细胞制品：将细胞铺到玻璃底平皿或腔室盖玻片中。
对于转染后固定的细胞制品：将细胞移植到置于 6 孔或 12 孔组织培养皿中的玻璃盖玻片上。
容器的最终选择取决于细抱在转染后是否需要微注射；如果需要. 则应根据针头操作需要来考虑器皿的形状和剩余空间。
对于悬浮细胞，固化柯以更方便地使用像明胶（0.1%,m/V,PBS; 高压灭菌）或聚 L-赖 氨酸（0.01% 水溶液，m/V) 等培养基。两种情况下, 均采用所选择的培养基覆盖小孔、盖片或者盖玻片约 30 min 来对上述材料表面进行包覆，再吸出过剩的培养基，然后，将细胞直接移植到培养基裏盖的表面。在转染操作过程中，细胞也可以保持在混悬液中，到成像前再立即固化细胞一旦固化后，就可以进行微注射了。
将细胞按-定的密度涂板，使约 40% 的细胞在第二天可以融合。
2. 采用第 16 章中所介绍的任意一种转染方法，用编码了 GFP 标记的目标蛋白的质粒转染细胞。
3. 转染细胞在适当条件下孵化 16~24 h, 以使细胞表达目标蛋白。
在有些情况下，必须梢确控制蛋白质表达水平。此时，建议在进行 FLIM 測定前先优化转染效率以及表达周期，可以采用调整的增强子来促进蛋白质的表达（请参见第 17 章)，或者采用核微注射来替代转染（请参见本方案结束处的“替代方案，活细胞的微注射”）。
4. 表达了目标蛋白质的细胞的鉴别。
5.(可选）如果实验设计允许, 选择第 6 步后面的替代方案，即微注射 (用于活细胞）或者固定和染色 (用于固定细胞)，中的一种方法来导入另一探针 (如: 标记蛋白）。
6. 在进行显微实验以前，立即用 CO2 非依赖性成像培养基（市售培养基或按材料项介绍的方法调整的经 Dulbecco 修改的 Eagle’s 培养基) 替换培养基。
在实验设计中，如果在有关的处理前需要将细胞血清饥饿，则在成像前按所介绍的时间段让细跑饥饿。但是, 如果细胞在缺乏血浆时会发生凋亡的话，就应在饥饿期间将细胞置于 0.5% 的胎牛血淸中，然后在成像前立即用无血淸培养基替换。
第三阶段 FLIM·FRET 测量
材料
专用装置
放大器（ENI403LA 或 Intra-actionPA-4)
氩激光（Coherent,Innova70C)
宽带绝缘反射镜（2 个；Newport Corporation)
检测器
MCP，HamamatsuC5825 或 LaVision Picostat HR
CCD, 配备 Kodak KAF 1400 芯片的 Photometries Quamix
滤光器
GFP,OG(Q495LP,HQ5lO/20;Chroma)
Cy3(HQ545/30,Q565LP,HQ610/75;Chroma)
单面镀银反射镜（Zeiss)
曲镜座（2 个)，透镜支架（2 个)，标竿（5 个），以及后支架（5 个）（Newport)
倒置显微镜（Zeiss 135TV)
IPLab Spectrum(Signal Analytics)
可变光圈（Comar)
透镜（分别为焦距 12 和 7.6 cm、焦距 2.5 和 3.8 cm;Newport)
水银灯（100 W Zeiss;HBO 100 AttoArc)
Multimode fiber step-indexed 1-mm core(步长指数 1 mm 内核的多态纤维）
(Newport)
油接物镜（100X/1.4NA;ZeissFluar)
光学操作台（2X1m;TMC)
Power meter 和 head (Ophir,Nova Display 和 2A-SH)
配备 PCI-GPIB 卡（National Instruments) 的 Power PC(Macintosh)
快门（高速)Vincent Associates,UniblitzVS25)
快门启动器（Vincent Associates,UniblitzVS25)
驻波声-光调制器（acousto-optic modulator,AOM)(Intra-action,80MHz)
倍频合成器（IFR2023)
可变密度滤光器滑轮（Laser Components)
水循环冷却装置（Grant)
细胞和组织
按第二阶段所介绍的方法制备表达了蛋白质探针的细胞（活的或固定的)
方法
1. 调节波长选择棱镜，选定 488nm 的氩激光为激发波长。采用激光背面的控制旋钮微量调整高反射镜面的位置来优化输出功率。
2. 设定频率合成器来启动 AOM 至共振频率约为 40MHz(对于这里所介绍的实验，采用的启动频率为 40.112MHz)。这使得激光束以两倍于驱动频率（80.224MHz) 的强度振动。
3. 通过调节入射角的角度和用光度计监测非衍射零级光的强度来优化 AOM 的衍射以及调制强度。在优化的衍射角度（达到相应的最大衍射）时零级光的输出功率最小。
4. 开启 MCP 和 CCD。将光阴极电压的基底值设为-2V, 并调整增益以匹配 CCD 的满动力范围。这取决于样品的荧光强度，并需要凭经验来确定。最理想的是，使增益值尽可能小以降低噪声。通常将 Hamamatsu C5825 的增益值设定为 1, 而 Photometrics Quantix CCD 的增益值设定为 3。将 CCD 的示值读数设定为 2X2 栅格。
5. 将主频率合成器驱动 MCP 的频率设定为驱动 AOM 频率的两倍（对于上面所举的例子即为 80.224MHz)。
6. 选择最合适的物镜来进行实验。在本例中使用的是 Zeiss Fluar 100x/1.4NA 油物镜。
7. 为了得到零级寿命参照图像，从强扫描开始每相隔 22.5°记录整个一周 16 张相位依赖性图像（例如：将一小片铝箔置于盖玻片或玻璃底平皿的成像表面)。
a. 将荧光滤器部件改为单面镀银反射镜，并用可变强度滤光滑轮将外来光的强度调至最小值。将聚焦点调整至铝箔表面。
注意：当设置铝箔成像时，在将外来光源的强度调至最小值以前，千万注意不要直接用肉眼看显微镜。
b. 照一张曝光时间约为 100ms 的铝箔图像。这张图像是用来选择 ROI 并估计所需的最佳曝光时间的。因为此时主频率合成器的相位可能不是最大的，为了避免检測器的饱和，应该选择可以生成约 1000 个计数的曝光时间。
c. 每相隔 22.5°记录整个一周 16 张相图，测定图像系列中达到最大强度时的相位，并在主频率合成器上重新将该相位设为 0 度。
d. 记录铝箔另一周十六张相图并记为零级寿命参照图像。
当进行寿命成像时，我们建议随时监测相稳定性。我们的装置一小时内相位可以稳定在 0.3°以内。对于我们的装置，每小时记录并保存一组参照铝箔像序列。
8. 将外来激发光源保存为最大（利用可变强度滤光滑轮）；这样系统就已经准备好可以采集细胞的图像资料。
9. 用 GFP 滤光器设置（分光器：Q495LP, 激发装置：HQ510/20) 获取一张供体图像。曝光时间设定为能达到 75% 的 CCD 动态范围（对于 12 位 CCD 为 3000 个计数)。在图像中选择感兴趣的区域来測定荧光寿命。
10. 制备供体荧光寿命图谱：
a. 获取两个邻近的、一个正相另一个反相循环的 16 张相位依赖性图像（间隔 45°相位）系列来校正相淬灭。按第 9 步的方法优化每一张相图的曝光时间设置。
b. 在没有样品照射的情况下获取另一张图像。将这张去除背景的图像从系列的所有相图中提取出来，然后将正相和反相循环中每一对相同相位的图像进行一级加和来修正供体的淬灭。
c. 由这些资料以及零级寿命参照图像（铝箔），按照本方案导言部分关于图像操作的讨论中所介绍的方法来计算供体荧光寿命图谱。
11. 记录受体的图像，然后将照明光源改为 100W 水银灯（Zeiss Attoarc) 来淬灭受体。将 Cy3 滤光部件（激发装置：HQ545/30; 分光器：Q565LP; 发射装置：HQ610/75chroma) 移到检测通路中。将曝光时间优化到可以占满 CCD 整个动态范围后，获取受体图像。在不能检测到 Cy3 荧光的条件下，关闭检測器部件，照射受体。
重要，当进行受体的光漂白实验时，明确光漂白以后，在供体通道内的受体的光产物没有荧光这一点是极为重要的。
