酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术
酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术（APAAP法）
【基本原理】
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，是一种免疫组化技术。用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb
，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影响，特异性强。目前已广泛用于淋巴细胞分化抗原、活化抗原、MHC-I、II类抗原表达的检测等。
【试剂及材料】
① APAAP试剂盒
② T缓冲液(pH7.6 0.05mol/L Tris-HCl)： Tris 30.25g，NaCl 40.0g，HCl 11ml，加蒸馏水溶解至500ml，调pH值至7.4～7.6。抗体稀释用含1％牛血清白蛋白的T。
③ Mayer苏木精复染液：苏木精0.1g，钾明矾5g，柠檬酸0.1g，水合氯醛5g，碘酸钠0.02g，蒸馏水100ml。将苏木精、钾明矾和碘酸钠溶于蒸馏水，再加温搅拌溶解，加柠檬酸和水合氯醛，混合后煮沸5min，冷却后过滤备用。
④ 纯丙酮
⑤ McAb
【操作方法】
① 取经过预处理（固定或脱蜡）的组织切片、细胞爬片或甩片；
②纯丙酮固定5min，空气中干燥10min，T浸洗5min；取出玻片仔细擦干，用蜡笔在细胞周围划一圆圈；
③在圆圈内滴加第一抗体20～50μl，放湿盒内37 ℃温育1h或4 ℃过夜。T浸洗5min，吸干；
④滴加二抗10～50μl，放湿盒内37 ℃温育30～60min，T浸洗5min，吸干；
⑤滴加APAAP复合物10～50μl，放湿盒内37 ℃，30～60min，T浸洗5min，吸干；
⑥滴加底物显色液10～50μl(临用前配制，取底物溶液1ml加坚固红1mg，充分溶崐解后使用)，放湿盒内37 ℃温育30min，T浸洗5min，擦片；
⑦加Mayer苏木精复染1min，用自来水冲洗。空气中干燥；
⑧高倍镜下观察：以细胞膜上或胞浆着红色为阳性细胞，无色者为阴性细胞，并计算阳性细胞百分率。
【附注】常用底物配制
1．辣根过氧化物酶（HRP）的常用底物配制
(1)H2O2/OPD：OPD 4mg溶于10ml pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸4.86ml加0.2mol/L
Na2PO4 5.14ml)中， 加入3%H2O2
50ml混匀，避光。临用时配制。H2O2/OPD的呈色反应为棕色，比色波长为492nm。终止液为2mol/L H2SO4。
(2)H2O2/TMB（或TM）：用DMSO将TMB（或TM）配成10mg/ml原液，4℃保存。临用前用pH5.4枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸8.85ml加0.2mol/L
Na2PO4 11.15ml)稀释成0.1mg/ml(TMB)或0.2mg/ml(TM)，每ml加入0.75%H2O2
4.2ml，此溶液应在1h内使用。H2O2/TMB（或TM）的呈色反应为蓝色，比色波长为450nm。反应终止液为2mol/LH2SO4。
（3）H2O2/ABTS：ABTS 3mg溶于10ml 枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸与0.2mol/L Na2PO4
等量混合)中，加入3%H2O2 10ml。H2O2/ABTS的呈色反应为绿色，比色波长为410nm。反应终止液为1.25%NaF。
（4）H2O2/DAB：DAB 4mg先溶于0.2mlDMSO或0.5ml丙酮，然后用0.01mol/L pH7.4 补至10ml，加入30%H2O2 50ml。H2O2/DAB的呈色反应为棕色，产物不可溶，常用于免疫组化染色，临用时配制。
2．碱性磷酸酶（AP）的常用底物
对硝基磷酸盐()： 3mg溶于5ml 10%二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺9.7ml，MgCl2·6H2O 10mg，NaN3 20mg溶于蒸馏水，以1mol/L HCl校正为pH9.8，加水至100ml， 4℃保存。
