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免疫碱性磷酸酶组织化学实验——间接免疫碱性磷酸酶法

2019.4.06

免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶（AKP 或 AP）取代 HRP 来显示结果的免疫酶组织化学技术。最早出现的是间接免疫碱性磷酸酶法（IAP），1983 年 Mason 及 Moir 等建立了碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）复合物法。随后，人们建立了更为敏感的生物素-亲和素-碱性磷酸酶复合物（ABC-AP）法、S-P 碱性磷酸酶法、EnVisicm 碱性磷酸酶法以及用于原位杂交检测的抗地高辛（Dig）、抗生物素（biotin）和抗荧光素（FITC）-AKP 检测系统。因免疫碱性磷酸酶技术具有独特优点，如敏感的酶底物显色系统、染色背景低，故应用日益广泛，尤其在原位杂交、TUNEL 等的检测。

本实验主要介绍间接免疫碱性磷酸酶（IAP）法和碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）法、S-P（AKP）法、EnVision 碱性磷酸酶法、PowerVision（AKP）法。

实验方法原理	此方法的基本原理与 HRP-抗体间接法类似，所不同的是用 AKP 代替 HRP 标记第二抗体，将其制备成酶标记抗体。
实验材料	石蜡切片动物血清
试剂、试剂盒	蛋白酶特异性一抗核固红二甲苯乙醇树胶 PBS AKP 标记的二抗 TBS（含左旋咪唑、MgCl2）
仪器、耗材	滴管玻片湿盒
实验步骤	1. 切片脱蜡至水，PBS 洗 3 min × 3 次。 2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。 3. 滴加正常血清，阻断 20 min（减少非特异性背录染色），吸去多余血清。 4. 滴加适当稀释的特异性一抗，37℃ 孵育 30～60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 min × 3 次。 5. 适当稀释的 AKP 标记的二抗 37℃ 孵育 30～60 min，PBS 洗 3 min×3 次。 6. 加入 0.02 mol/L（pH 9.0）TBS（内含 1 mmol/L 左旋咪唑，5 mmol/L MgCl₂）阻断内源性碱性磷酸酶。 7. 切片上滴加 50～100 μl 底物溶液（BCIP/NBT），室温中湿盒内避光显色 30 min～48 h，显色 30 min 后镜下观察，待阳性充分显示后水洗终止反应。 8. 充分水洗后用核固红复染 5 min，冲洗后系列乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。 9. 结果观察，背景呈红色，阳性产物呈紫蓝色。展开
注意事项	1. 染色结果可根据不同的显色底物而显示不同颜色，如用坚固红（FR/AS-MX）产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝（FB/AS-MX）则产物为紫绿色，而 BCIP/NB 丁为紫蓝色。 2. 特别要强调的是，FR/AS-MX 和 FB/AS-MX 底物系统产生的颜色反应产物，能溶于有剂溶剂，如乙醇、二甲苯，所以不能用树胶封片。