变性条件下的凝胶电泳实验
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
梯度胶凝胶电泳
SDS-尿素胶凝胶电泳
| 实验方法原理 |
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE 因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。 我们对 SDS-PAGE 的介绍包括线性薄胶的操作步骤，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一块胶上跑很多样品，使聚合、染色、脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶应用的更为广泛。对于分析性的应用，既可以减少电泳所需的时间和原材料，也可以提高分辨率，所以小的薄片胶更受入青睐。本章所介绍的实验步骤及试剂均是根据 Bio-Rad 的小凝胶系统来计算的。但这些步骤也适用于其他系统。另外，有些情况下需要使用梯度胶。 |
|---|---|
| 实验材料 | 蛋白质溶液 |
| 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺（电泳级） 双丙烯酰胺 Tris 碱 SDS TEMED 过硫酸铵 α- 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝 甘氨酸 盐酸 |
| 仪器、耗材 | 微型凝胶电泳装置 100℃ 沸水浴 Eppendorf 管 微量注射器（50 ul 或 100 ul） 干胶器 真空泵或水泵 带盖的玻璃或塑料小容器 摇床 |
| 实验步骤 |
1. 储存液的配置 （1）2 M Tris-HCl（PH 8.8），100ml 称取 24.2g Tris 碱；加 50ml 蒸馏水； 缓慢的加浓盐酸至 pH 8.8（约加 4 ml）；让溶液冷却至室温，pH 将会升高； 加蒸馏水至 100 ml。 （2）1 M Tris-HCl（PH 6.8），100ml 称取 12.1g Tris碱； 加 50ml 蒸馏水； 缓慢的加浓盐酸至 pH 6.8（约加 8 ml）；让溶液冷却至室温，pH 将会升高； 加蒸馏水至 100 ml。 （3）10％（w／v）SDS，100 ml。室温保存 称取 10 g 的 SDS； 加蒸馏水至总量为 100 ml。 （4）50％（v／V）甘油，100ml 到取 50 ml 100％ 的甘油； 加入 50 ml 蒸馏水。 （5）1％（w／v）溴酚蓝，10ml 称取 100 mg 溴酚蓝； 加蒸馏水至 10 ml，搅拌直到完全溶解； 过滤除去聚合的染料。 2. 工作液的配置 （1）A液：丙烯酰胺储存液，100 ml 30％（w／v）丙烯酰胺，0.8％（w／v）双丙烯酰胺， 29.2 g 丙烯酰胺 0.8 g 双丙烯酰胺
3. 灌制分离胶 （1）组装凝胶模具叫按照使用说明书，装配好灌胶用的模具。 对于 Bio－Rad 的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触（见图 1），钉细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。
（2）将 A 液、B 液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺（A 液中）是神经毒素，操作时必须戴手套。 （3）加入过硫酸铵和 TEMKD 后，轻轻搅拌使其混匀（过量气泡的产生会干扰聚合）。凝胶很快会聚合，操作要迅速。 （4）小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内（见图 2），这样可以避免在凝胶内产生气泡。
（5）当加入适量的分离胶溶液时（对于小凝胶，凝胶液加至约距的玻璃板顶端 1.5 cm 或距梳子齿约 0.5 cm，见图 3）。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层 1～5 mm 的水层，这使凝胶表面变得平整。
（6）等待 30～60 min，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。另外的办法是将灌完分离胶后剩余的凝胶溶液置于一个小容器内，作为检测凝胶聚合的标志。如果凝胶渗漏，但还没有覆盖水层。可以回收分离胶溶液，重新装配玻璃板和隔片，在凝胶聚合之前重新灌胶。分离胶可在 4℃ 储存一周。 4. 灌制堆积胶 （1） 吸尽覆盖在分离胶上的水； （2） 将 A 液、C 液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合； （3） 加入过硫酸铵和 TEMED，并轻轻搅拌使其混勻； （4） 将堆积胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端（见图 4）；
（5） 将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐（见图 5 和图 6）。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生；
（6） 约 30 min 凝胶聚合； （7） 凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂； （8） 将凝胶放入电泳槽内，如果使用 Bio-Rad 的微型凝胶系统，可预先接好电极； （9） 将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。 5. 制备样品和上样 （1）每孔的上样量（Bio-Rad 的微型凝胶系统） （2） 将蛋白质样品与 5× 样品缓冲液（20 ul＋5 ul） 在一个 Eppendorf 管中混合； （3） 100 ℃ 加热 2～10 min； （4） 离心 1 s，如果有大量蛋白质碎片则应延长离心时间； （5） 用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部。 并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。 6. 电泳 （1） 将电极插头与适当的电极相接。电流应流向阳极； （2） 将电压调至 200 V（保持恒压；对于两块 0.75 mm 的胶来说，电流开始时为 100 mA， 在电泳结束时应为 60 mA； 对于两块 1.5 mm 的胶来说，开始时应为 110 mA， 结束时应为 80 mA。）； （3） 对于两块 0.75 mm 的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需 30～40 min（1.5 mm 的凝胶则需 40～50 min）； （4） 关闭电源； （5） 从电极上拔掉电极插头； （6） 从电泳槽中取出凝胶玻璃板； （7） 小心移动两玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。 7. 考马斯亮蓝染色 （1）戴上手套避免将手指印留在电泳胶上，将胶移入一个小的盛有少量考考马斯亮蓝（20 ml 已经足够）的容器内（小心不要将胶撕破）、或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落； （2）对于 0.75 mm 的凝胶，可在摇床上缓慢震荡 5～10 min，对于 1.5 mm 的凝胶，则需 10～20 min， 在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口； （3） 弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色； （4） 加入考马斯亮蓝脱色液（约 50 ml），清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要 1 h， 使用过的脱色液则可用水冲冼掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。 8. 银染色 （1） 戴上手套，将凝胶移至一个盛有 50％ 中醛和 10％ 醋酸混合液的小容器内，至少浸泡换液 2～3 次； （2） 用清水漂洗 30 min， 期间至少换水 3 次； （3） 准备溶液 A，B、C； （4） 将凝胶移入一个干净的容器内，在持续温和振摇下用 C 液染色 15 min； （5） 用去离子水漂洗凝胶，在轻轻振摇下浸泡 2 min； （6） 准备溶液 D； （7） 将凝胶移至一个干净的容器内，用溶液 D 洗涤，显色。银染的电泳带一般在 10 min 内出现，则更换溶液 D。如果背景已开始变为淡黄色，则应该停止反成； （8） 将凝胶浸入 1％ 的醋酸终止反应； （9） 在蒸馏水中漂洗凝胶至少 1 h， 换水三次； （10） 如果蛋白质染色太深，则可用 Kodak Rapid Fix 或 Kodak Rapid Unfix 使电泳胶脱色再用 Kodak clearing agent（如 Orbit） 终止脱色，然后用 50 ％ 甲醉/10 ％ 的酷酸漂洗； （11） 将凝胶保存于水中或进行干胶。 9. 干胶 （1） 将凝胶置于一个干净的表面上（玻璃板或洁净的操作台上）； （2） 用蒸馏水做润滑剂，调整加样孔间隔胶便其保持垂直； （3） 用一张 10 cm×12 cm 的 Whatman 3 MM 滤纸覆盖凝胶，将滤纸连同凝胶从玻璃板或操作台上揭下来，凝胶会粘在滤纸上； （4） 用一张玻璃纸或塑料保鲜膜覆盖在凝胶的表面，小心不要将气泡裹进去，这样会导致凝胶的破裂。可用一个试管作为卷轴拖运可以有效的除去气泡； （5） 将 Whatman 滤纸与凝胶置于干胶器上，开启加热和抽真空开关，并盖上带有密封圈的盖子。
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| 注意事项 |
1. 丙烯酰胺：有剧毒，可导致中枢神经麻痹，也可能有致癌和致畸变作用。可被正常皮肤吸收。如果皮肤接触了丙烯酰胺的粉末或溶液相，立即用肥皂水冲洗。未聚合的丙烯酰胺仵过量催化剂以固体废物形式处理。 2. 过硫酸铵：可以用水稀释后冲洗弃之。 3. TEMED： 用避光的瓶子在 4℃ 保存。有报道认为保存 10～12 个月后活性显著下降。 4. 硝酸银：有毒及皮肤刺激。混合的氢氧化银铵溶液（溶液 C） 水分蒸干后形成烈性炸药，因此用完后 Ag2＋应立即加盐酸使其沉淀。
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